定量PCR基本原理及方法.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,荧光定量,PCR,基本原理,荧光定量,PCR,标记方法,荧光定量,PCR,不同方法学的应用,内容,定量,PCR,技术的产生,1992,年由,Higuchi,等：使用,EB,加入,PCR,反应体系，经改装的带有冷,CCD,的,PCR,仪检测样品的荧光强度,染料荧光强度间接反映核酸的量,后来用与双链,DNA,有更强结合力的,SYBR Green I,取代,EB,荧光定量,PCR,基本原理,荧光定量,PCR,的定量原理,Y,：扩增产物数量,X,：起始模板数量,n,：扩增循环数,Y,=,X,*,2,n,=(1+Ev),Lg,X,=b,Ct,*a,模板的Ct值与其起始拷贝数的对数存在线性关系。利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，根据未知样品的Ct值，即可计算出该样品的起始拷贝数。,Ct,值与起始模板的对应关系,Y轴Ct值,X起始拷贝数的对数,1006,1005,1004,1003,1002,1001,高,低,低,高,Ct,标准曲线,由系列稀释的已知浓度的样品做标准曲线,计算待测样品的初始模板浓度,Lg,X,=b,Ct,*a,绝对定量,未知浓度的样品与标准曲线相比较,X1,X2,Ct1,Ct2,基于双链DNA 内掺染料的方法,LUX,AmpliFluor Uniprimer,基于引物的方法,基于水解的方法,TaqMan,(5 nuclease assay),TaqMan MGB,MGB Quantiprobe/Eclipse,LNA oligos,Adjacent probes/HybProbes,Molecular beacons,Scorpions,基于杂交的方法,Non-PCR,DNA invader,AmpliDet RNA,(beacons+NASBA),Rolling-circle amplification,基于探针的方法,EB,（第一代）,SYBR Green 1,（,第二代）,LC Green Plus,SYTO 9,（,第三代）,EvaGreen,荧光定量,PCR,标记方法,双链DNA 内掺染料,EB,（,第一代）,SYBR Green 1,（,第二代）,LC Green Plus,（,第三代）,第一代常规,双链DNA内,掺式染料：,溴化乙锭,(EB),首个应用于均一实时检测的方法,Russell Higuchi et al.1992,Simultaneous amplification and detection of specificDNA sequences.BioTechnology 10:413417,荧光信号随双链DNA和出现而增强,信号弱，并且EB对PCR扩增有毒性,已不再使用,第二代常规,双链DNA内,掺式染料：,SYBR,Green I,价格便宜，使用简便,更亮,效果优于,EB,广泛应用,可用于熔解分析,+,电泳分析,LC Green,I,染料饱和后使其在熔解过程中没有空位进行重组,饱和染料毒性低,高浓度可以使,DNA,达到饱和,降低了染料位置重组的可能,LC Green,LC Green,Plus,SYTO 9,EvaGreen,饱和染料,SYBR,Green I 对PCR扩增有毒性，,因此必需使用低浓度的染料,SYBR,Green I,一些染料在熔解开始后可以重新定位,第三代常规双链DNA内掺式染料：,5,3,5,3,SG,Excitation,SG,SG,SG,SG,Emission,内掺式染料,SYBR-Green I,5,3,5,3,SG,SG,SG,SG,SG,Excitation,Emission,内掺式染料,SYBR-Green I,基于寡核苷酸的标记方法,染料标记的引物,染料标记的探针,外来光能,荧光共振能量传递（,FRET,）,原理,所有基于寡核苷酸的方法的共同基础,R=,报告基团,Q=,淬灭基团,R,Q,R,Q,R,Q,靠近时发生能量转移,报告基团信号减弱，淬灭基团信号增强,(Frster,Ann.Phys.,1948),FRET=Frster Resonance,Energy Transfer,through space,基于水解探针的标记方法,TaqMan,(5 nuclease assay),TaqMan MGB,R,Q,5,3,5,3,5,3,5,3,Excitation,R,Q,Q,R,Q,R,Excitation,基于水解探针的标记方法,Taqman,R,=,报告基团,Q,=,淬灭基团,TaqMan 探针特点：,淬灭基团通常用TAMRA(染料)标记，TAMRA有很强的荧光,TAMRA 荧光导致人们无法使用该波长范围的其它报告染料用于多通道实验,探针长度可能超过30(探针 T,M,通常 70)当探针长度超过30bp，,T,M,就无法被准确计算，从而需要进行特殊设计,长探针不易于目标序列结合,长探针可表现出显著的错配现像,R,Q,=TAMRA,3,探针,GCTACACAGTCCGGAACTCTCTATAGCATCACAC,AGGCCTTGAGAGATAT,R,|,Q,基于水解探针的标记方法,TaqMan MGB 探针,第二代水解探针，特点：,1.,用一个分子钳控制较小的探针大小 2.用一个非荧光淬灭基团来取代TAMRA荧光基团,AGGCCTTGAGAGATAT,R,Q,(,非荧光淬灭基团,),NFQ,Q,MGB,(DNA,小沟结合物,),双链DNA小沟上的MGB钳模型,更好的设计灵活性和更短的扩增子,25bp,15bp,20bp,TaqMan,MGB,探针个体小,TAMRA,探针,38-mer:ACTTTTCTGTAAGTAGA,T,ATAACTTTTCAAAAAGACAG,平行的,MGB,探针,17-mer:,CTGTAAGTAGA,T,ATAAC,基于杂交的标记方法,MGB Quantiprobe/Eclipse,LNA oligos,Adjacent probes/HybProbes（FRET）,Molecular beacons,Scorpions,QIAGEN,Quantiprobe,MGB assay,*,超级碱基：,SuperA,SuperT,互补的碱基形成特别牢固的键（类似于G-C键）以提高杂交性能,使用于Taqman相同的,*,基于杂交探针的标记方法,带有 MGB 钳的杂交探针,基于杂交探针的标记方法,LNA,寡分子,Locked Nucleic Acid primers and probes（,锁定的核酸引物及探针）,什么是 LNA?,LNA 是一种新型的核酸类似物，它含有一个 2-O和一个 4-C 亚甲基桥。这个桥限制了呋喃核糖环的活动性，并将结构固定于一个坚固的双环构象中，从而提供了更强的杂交表现和额外的生物稳定性,卓越的杂交特性,+,加强的生物稳定性,与,MGB,寡分子相似的效力,免费设计服务,引物，,TaqMan,探针,(FAM,JOE,TAMRA BHQ1 etc),分子信标,Scorpions,LightCycler,探针等,例,用TaqMan 探针检测 C-到-T 色氨酸羟化酶(TPH)SNP:,5-(JOE)cagAaA,C,gCtAttgat(BHQ1)-35-(FAM)tacAgAaA,T,gCtAttgatt(BHQ1)-3(LNA 碱基用大写字母表示),参考文献：Locked nucleic acid(LNA)single nucleotide polymorphism(SNP)analysis and validation using real-time PCR.Nucleic Acids Research 2004 Vol 32,No 6 e55Johnson,Haupt and GriffithsGriffith University,Gold Coast,Qld,基于杂交探针的标记方法,LNA,寡分子,Locked Nucleic Acid primers and probes（,锁定的核酸引物及探针）,R,Q,Excitation,R,Q,Q,R,Excitation,Emission,基于杂交探针的标记方法,分子信标,分子信标特点：,最佳信标杆的设计是至关重要的，必需能够折叠成正确的结构否则荧光基团如不能立即靠近淬灭团，会导致高背景信号。,如果干的信标杆杂交太强则会影响与目标序列的退火。因此，对于每一个分子信标都必需执行热变性步骤以确定他们的熔解特性。,随着循环的进行，背景信号可能会因探针的水解而增加。,Beacon Designer,软件可从,Premier,Biosoft,公司购买,:,Oligo 1:Fluorescein,Oligo 2:LC Red 640,Excitation,Emission,Transfer,基于杂交探针的标记方法,荧光共振能量传递,双功能引物/探针分子,免费设计软件“Scorpio”可从DNA Software获得：,www.dna-,基于杂交探针的标记方法,蝎子引物,基于杂交探针的标记方法,蝎子引物,反应机理：,Step 1,:引物在目标DNA上延伸,Step 2,:到达变性温度时，淬灭基团脱落,Step 3,:降温过程中，探针序列与特定目标序列结合，没有延伸的引物信号被淬灭,+,探针,靶序列,+,结合时荧光信号淬灭,基于杂交探针的标记方法,置换探针,Yin-yang,probe,陰陽蛇,基于引物的标记方法,Amplifluor Probe,5,3,5,3,5,3,5,3,3,R,Q,5,R,Q,R,Q,3,5,Q,R,R,R,Emission,Excitation,Q,R,设计软件：,R,Q,Excitation,Emission,R,Q,Q,R,Excitation,3,基于引物的标记方法,LUX引物,Designer,标记,FAM,或,JOE,，无需淬灭基团，,发夹结果中,C,碱基作为淬灭基团,基于引物的标记方法的特点：,信号产生于与标记引物结合的所有产物,它同样可以是引物二聚体和非特异性扩增产物,不像探针方法可提供客户的特异性保证验证,有报告称，这种方法的信号相对较弱,需要特殊的设计软件或设计服务,非PCR的方法,例：,3,rd,Wave公司的DNA Invador,非PCR的方法,Invader assay 用于SNP检测,T,WT target,5,3,第 1 步,探针寡分子与目标杂交,N,Invader probe,5,A,Target probe,flap,5,3,N,T,A,WT target,Invader probe,Target probe,flap,5,5,5,3,3,非PCR的方法,Invader assay 用于SNP检测,第 1 步,形成三聚体结构,3,剪切酶,执行切割,N,T,A,WT target,Invader probe,Target probe,flap,5,5,5,3,3,第 1 步,剪切酶定位于三聚体结构上,非PCR的方法,Invader assay 用于SNP检测,N,T,WT target,Invader probe,Target probe,5,5,3,3,A,5,3,flap,非PCR的方法,Invader assay 用于SNP检测,第 1 步,“flap”序列被释放,(rate=1000/hr/template 63,o,C),T,A,Reporter casette,5,5,R,Q,A,5,3,flap,第 2 步,释放的被设计为与完整的报告模块（reporter cassette）相杂交,(由于FRET效应，报告荧光的信号减弱),非PCR的方法,Invader assay 用于SNP检测,A,T,A,flap,5,5,5,剪切酶,执行剪切,Q,R,Reporter casette,非PCR的方法,Invader assay 用于SNP检测,第 2 步,剪切酶再次定位于重叠结构上,A,T,A,flap,5,5,5,报告荧光信号增架,(不再发生淬灭效应),Q,R,Reporter casette,非PCR的方法,Invader assay 用于SNP检测,第 2 步,报告染料生模块（casette）上释放,Invader assay,优点：,均,一且等温的反应,(,无需循环,),无,需核苷酸,(,没有携带污染的风险,),只,依赖于结构,化,学反应不依赖于,兼容,多重反应,反,应特异性的寡分子是非标记的,缺点：,噪音,（高,背景信号会引发问题）,并,非所有的实验都能成功,（,设计的问题）,荧光定量,PCR,不同方法学的应用,研究目的,标记方法,定量分析（基因拷贝数的绝对定量，基因表达调控的相对定量）,Sybr,-Green(LC Green),Taqman,etc,研究目的,基因型分析（,SNP,、突变型分析）,Taqman,Molecular Beacon,FRET,HRM,熔解曲线分析,Sybr,-Green,HRM,Molecular Beacon,FRET,某科研用户使用Rotor-Gene 3000进行基因表达检测结果,（自备标准品，检测样品做复管）,定量分析,绝对定量,某科研用户使用Rotor-Gene 3000进行基因表达相对定量分析，下图为用Ct法得出的分析结果。,（自备标准品，检测样品做3次重复复管）,HouseKeeper Gene,Gene of Interest,定量分析,相对定量,根据熔解曲线区分样品：等位基因区分、扩增特异性检测等,低引物浓度,(50 nM),电泳图上的单个条带实际含有两种基因型,(,等位基因含有不同序列,),高引物浓度,(900 nM),引物二聚低在较低温度处显示为第三条带,(,短片段更快溶解,),熔解曲线分析,Sybr,-Green I,利用Sybr-Green I溶解曲线进行实验条件的优化（RG3000）,Annealing at 60,Annealing at 63,熔解曲线分析,Sybr,-Green I,基因型分析,利用扩增信号的种类来分型,Taqman,根据熔解曲线的不同来分型,FRET,Molecular Beacon,HRM,双Taqman探针法检测野生型和突变型,在基因型分析中，可采用两种不同的Taqman探针（分别针对野生型和突变型)，即一个,突变型,探针以一种荧光素（,Flr,）标记，而,野生型,探针则用不同的荧光物（,Tet,）标记。如果只有一种信号被扩增出来，则样本为对应的基因型（野生型或突变型）的纯合子；如二者都被有效地扩增出来，则样本为杂合型。,利用扩增信号的种类来分型,杂合型,野生型,突变型,FRET探针进行熔解曲线分析确定基因型,FRET探针与模板结合时，因共振能量的传递而信号增强，而当在T,m,值时，FRET探针与PCR产物分开，荧光信号减弱。通过实时捕捉到的PCR产物在熔解过程中荧光信号的变化，得到PCR产物的熔解曲线。因为发生基因突变的PCR产物有特定的T,m,值，通过测定探针与PCR产物分开时的熔解温度T,m,值，就能确定样品的基因型。,利用熔解曲线检测基因突变,杂合型,野生型,突变型,利用饱和染料运用HRM高分辨率熔解曲线对样品的多态性位点进行分型。无需序列特异性探针，即可对单碱基差异进行区分。,杂合子形成杂合二倍体，形成较低温的熔解曲线和两个转换点。,G A T,C T A,G A C,C T G,G A T,C T,G,G A C,C T,A,利用熔解曲线检测基因突变,标记方法,Taqman,定量分析，基因型分析,内掺染料法,定量分析，熔解曲线分析，基因型分析（饱和染料）,Molecular Beacon,定量分析，熔解曲线分析，基因型分析,FRET,定量分析，熔解曲线分析，基因型分析,Ampliflour,Probe,，,LUX,定量分析,谢谢！,专才服务专家,