实验动物-基础.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第一节 导 论,实验动物学,是进行生物医学研究的基础性学科，它应用生物学、畜牧、兽医学及医学基本理论、基本技术和有关学科的基础知识，系统地阐述实验动物的生物学特性、育种、繁殖、饲养管理，疾病的预防、治疗，环境、遗传、微生物、营养，动物实验设计、实验方法的优化、实验过程的控制，以及实验动物的麻醉、镇痛和安乐死，动物实验的替代，动物实验的伦理，动物福利的保障等。,一、实验动物学,20世纪50年代后期，在近代生物医学发展过程中，对实验动物质量和动物实验结果准确性的要求，越来越高，于是就诞生了一门独立的专门研究实验动物和动物实验的科学实验动物学。前者是研究实验动物的遗传、育种、质量控制、疾病防治以及动物福利等内容；后者指以科学实验研究为目的，在动物福利得到保障的前提下,，,对动物进行各种处理，获得新的、科学的实验数据。,实验动物学是一门比较年轻的科学，但它已经建立起自身完整的理论体系，也派生出相关分支学科，如：实验动物育种学、实验动物微生物学、实验动物环境生态学、实验动物营养学、实验动物医学、比较医学、动物实验、实验动物饲养管理等。,（二）实验动物和实验用动物,1实验动物,实验动物指人工培育的、来源清楚、遗传背景明确、对携带的微生物实行控制、用于科学实验、药品、生物制品生产、检定的动物。,实验动物标准化：,指实验动物生产条件（环境和设施）标准化、实验动物质量标准化（微生物学和寄生虫学控制，以及遗传质量控制）、动物实验条件标准化。,按照以上提到的条件和标准，,小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠、兔子,等进行多年人工饲养，已经完全成为合格的实验动物，其它一些哺乳类、鸟类、鱼类以及非人灵长类实验动物化的工作正在进行，还不是严格意义上的实验动物。,经济动物,也称家畜家禽，是以人类社会生活需要为目标，以经济性状（肉、乳、蛋、皮毛等）作为人工选择指标，定向驯养、培育、繁殖的动物。,野生动物,是指自然状态下生存的动物。为了研究的需要，人类有时从自然界捕获的这些动物进行动物实验研究，而没有进行人工繁殖、饲养。,(1)实验动物微生物学质量的影响,（,1）威胁人的健康和生命,流行性出血热病毒,（Epidemic hemorrhagic fever virus),淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（Lymphocytic choriomeningitis virus）,猴B病毒(B virus),狂犬病病毒(Rabies virus),布氏杆菌(Brucella),流行性出血热病毒,宿主动物主要是小型啮齿动物，实验动物中小鼠和大鼠比较常见。,传播途径以接触感染为主，常由带毒动物咬伤抓伤为主。,典型表现有发热、出血和肾脏损害三类主要症状，以及发热、低压，少尿、多尿与恢复期等五期临床过程。,淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒,病毒属RNA型病毒，宿主动物主要是仓鼠小鼠、田鼠等鼠类。,通过呼吸道及消化道及接触病鼠皮毛排泄物使人感染。,临床症状刚开始为流感型症状，后表现为脑膜炎型。,猴B病毒,病毒属疱疹病毒型，自然宿主为旧世羿猴，猕猴也可感染，无明显症状。,人,、猴之间的传播主要以密切接触、抓咬为主。,人感染后可出现脑炎等严重中枢神经症状，病死率较高。,狂犬病病毒,病毒属弹状病毒科狂犬病毒属，自然宿主广泛狼、狐狸、鼬鼠、蝙蝠等及家养动物狗、猫、牛等均可感染。,人主要被病兽或带毒动物咬伤后感染。,一旦感染，如不及时采取有效防治措施，可导致严重的中枢神经系统急性传染病，病死率极高。,（,2）影响动物生产,结核分枝杆菌(,M.tuberculosis,),鼠痘病毒(,Mousepox virus,),泰泽氏菌(Tyzzers organism),犬细小病毒(Canine Distemper Virus),犬瘟热病毒(,Canine distemper virus,),巴氏杆菌(,Pasteurella,),（,3）干扰实验结果,隐性感染，不表现临床症状。但改变动物生物学参数，影响实验准确性、规律性、重复性。实验刺激下感染显性化，得病、死亡，实验终止。,裸鼠慢性感染一些微生物,绿脓杆菌(,Pseudomonas aeruginosa,)感染免疫抑制动物,按微生物学控制标准，实验动物在我国分为四级,一级动物 普通动物,二级动物 清洁动物,三级动物 SPF动物,四级动物 无菌动物,2、实验动物遗传学质量的影响,动物实验结果的重复性取决于动物个体差异，而动物个体特征主要受遗传基因控制，故实验动物的遗传学质量对动物实验结果有重要影响。,不同基因型动物，生物学特性有明显差异，对实验刺激有不同反应。,BALB/c,对放射线比其他品系更为敏感。,C,57,BL/6,肿瘤发生率低，,A,系高。,DMBA,可致,BALB/c,产生白血病，对,A,系却产生皮肤溃疡,BALB/c,和,C,3,H,小鼠对鼠伤寒沙门氏菌的敏感性存在显著差异,SHR,为自发性高血压大鼠，心血管疾病发生率高,必须推广应用标准品系动物，防止各种品系动物发生遗传污染、基因型及生物学特性的改变，保证动物的遗传质量。,按遗传学控制标准即基因的纯合程度，实验动物分为,近交系,封闭群,杂交群动物,近交系 经至少连续20代的全同胞兄妹交配或亲代与子代交配培育而成，品系内所有个体都可追溯到起源于第20代或以后代数的一对共同祖先。,代表动物：BALB/c、C57BL/6、DBA/2,封闭群：以非近亲交配方式繁殖生产的一个实验动物种群，在不从其外部引入新个体的条件下，至少连续繁殖4代以上，称为一个封闭群，或叫远交群,代表动物：ICR小鼠、SD大鼠、毕格犬,杂交群：不同品系或种群之间杂交产生的后代称为杂交群。用于医学生物学研究常指两个近交系杂交后生育的第一代动物。,代表动物：如C3H/HeJAKR/J,实验动物生产与实验条件的标准化是对干扰动物实验的周围环境因素进行控制。,实验动物生产条件和动物实验条件的标准化,环境因素包括：,气候因素（温度、湿度、气流、风速）,理化因素（换气、粉尘、臭味、噪音、照明）,居住条件（笼具、垫料、房舍）,营养因素（饲料、水）,同种和异种动物之间的关系,2实验用动物,实验用动物,指来源于野生动物、经济动物或其它人工饲养的动物，经过人工选择、定向培育发展而来、用于生物医学研究的动物。实验用动物泛指一切用于科学实验的动物，除了严格意义上的实验动物外，还包括经济动物、野生动物或观赏动物，也包括无脊椎动物。实验用动物范围要比实验动物广得多。,实验用动物是指所有用于动物实验的动物，包括实验动物。而实验动物是为研究的需要而培育的。确定是否是实验动物，要经过一系列检测，如微生物和遗传基因等，经专家鉴定才能称其为实验动物.,3遗传修饰实验动物,目前，动物遗传工程技术日益成熟，这些技术经迅速扩展，培育大量的遗传修饰动物（genetically modified animals），大大丰富了实验动物的资源，为生物医学研究提供了一个强有力的工具。,转基因动物（transgenic animal）：采用显微注射技术将外源DNA溶液注入到小鼠受精卵的雄原核，用这种方种成功地获得了带有外源基因并能稳定遗传的动物。,嵌合体小鼠（chimera mouse）：携带外源基因的胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES），被注入于正常囊胚，发育成为嵌合体小鼠（chimera mouse）。,基因敲除（knock out）小鼠：内源性的基因被剔除（基因失活）后培育的工程化小鼠。,基因替换（knock in）小鼠：与某种生理现象相关的两个基因中的一个基因被另一个基因所替代后（基因功能改变）培育的工程化小鼠。,克隆动物（clone animal）：采用胚胎分割技术、核移植技术等培育克隆动物。,三、动物实验,动物实验类型：在此特指生物医学实验研究中使用了动物，并且实验过程会给动物带来疼痛或伤害的实验类型。如果利用动物的器官、组织和细胞进行的体外实验研究，不属于动物实验研究的范畴。,意义：进行动物实验研究有助于人们了解生物学基本知识、揭开生命的奥秘；有助于研究人类和动物疾病的成因，寻找新的诊断和治疗措施；有助于生物医学的教育和培训，如，医学院、兽医学院学生外科技术训练等。,在动物实验研究中，动物的反应（也就是动物实验的结果）可以简单总结为：R=（A+B+C）D+E其中，,R,是动物的反应，也就是动物实验处理的结果，,A,代表动物物种的反应，,B,代表动物品种或品系的反应，,C,代表个体的反应，,D,表示环境因素和动物种、品系、个体相互作用后对实验结果的影响，,E,代表实验误差。,四、医学研究和动物实验,在现代医学生物学研究的领域里，进行实验研究的条件可以概括为AEIR四个基本要素，A代表animal（动物），E代表equipment（设备），I代表information（信息），R代表 reagent（试剂）。其实，实验动物作为人类的替代者或模型，是伴随着生物医学一起成长、一起发展起来的。,在生命科学研究中，实验动物既是实验研究的载体，又是人类疾病的模型动物，同时还可以用来生产生物制品和进行生物学检测，实验动物也是军事、航天等诸多领域的“功臣”。在未来，实验动物不但可能成为人体器官移植的供体，而且是进行功能基因组和疾病基因组学研究的“核心模型”。,五、动物实验标准化,动物实验标准化,指使任何给定动物（或动物群体）的质量及其所处环境保持稳定，即动物质量和实验条件标准化,。,标准化动物实验可以增加实验结果的重复性，使实验室内和不同实验室之间动物实验结果的具有可比性。标准化也可以减少给定动物实验中同种动物定量度量值的变异，从统计学观点来看，减少动物个体间度量值变异，可以降低每次实验所需动物的数量。,（一）变异分析,动物实验的标准化只涉及当时已知可能的变异。度量值的变异来源于两种情况：,一是我们所知的实验间变异（between-experiment variation）或组间变异；,二是实验内变异或动物个体间差异（within-experiment 或inter-individual variation），也叫组内变异。事实上，两种变异都来源于动物本身以及实验过程中环境的影响。,1实验间变异,重复一个特定的动物实验，不管使用同一组或不同组动物，结果总是得到不同的度量值。处理会使对照组和实验组平均度量值发生变化，即组间变异。组间变异可以剖分为：动物个体度量值间变异和实验条件间变异。如果处理因素和实验条件之间发生交互作用，还有一个额外的因素使处理在每次实验中发生变化，可能会导致对实验结果错误的解释。,为了精确地评价处理效果,重复实验是必须的。处理效果应该是真正的效果，系统误差或干扰对它即不削弱、也不夸大。降低实验间效应变异将减少对同一实验的重复性，因而使实验动物的使用量减少。从科学的观点来看，实验结果不应依赖于动物实验进行的时间和地点，必须是建立在可重复实验的基础上。,2实验内变异 在一次实验中，相同的动物之间的定量度量值属于个体间的变异。这种实验内变异包括：实施实验过程造成的变异、分析变异、个体内变异（intra-individual variation）和固有的个体间变异（intrinsic inter-individual variation）。固有的个体间变异来源于每个动物个体的度量值，每个动物固有特性不同，而且基本上不依赖于动物所接受的处理。个体内变异是一个动物体不能标准化的变异组成，这种变异会使动物每天度量值上下波动。,3动物实验间和实验内变异的来源 动物实验中变异的一个重要来源是实验动物自身。,一个实验组中动物的差异或两个不同组间动物的差异来源于动物的年龄、体重、同窝动物的数量及其它可能在实验前就已经存在的差异。这些差异可以增加实验间或实验内度量值的变异，如果这个变异影响到对照组和实验组差异，将影响实验结果。个体间基因型的差异（包括性别），同样会增加度量值的变异。动物实验中的生物因素（动物携带微生物状况、性周期等）、物理因素（光照、温度等）、化学因素（营养、睡眠等）、群体因素（饲养密度、个体的相互作用）等环境因素也会增加实验结果的组间和组内变异。,动物实验获取的度量值基本上是由,遗传和环境的相互作用决定的,。遗传和环境的相互作用表现在各个层次上：环境对受精、胚胎发育到性成熟期的影响，被称作初期环境（primary milieu），初期环境和基因型的相互作用决定了动物的表型。初期环境后、动物实验前环境继续影响表型，形成演出型（dramatype），这是二期环境（secondary milieu）。动物受到实验过程和处理因素的影响，即为三期环境（tertiary milieu）。根据度量值的类型，基因型和环境之间的相互作用对实验间和实验内变异以及处理有不同的影响。,动物和环境的标准化 理论上讲，由于基因造成的个体差异可以通过使用基因型相同的动物来排除。近交系或F1代是同基因型动物，动物实验中观测度量值的个体间变异比不同基因型的动物（如，封闭群动物）要小的多。当然，遗传只是影响度量值众多因素中的一个因素。,实验动物携带的微生物能够影响度量值的多种变异。一些微生物隐性感染的动物，可以明显的增加不同实验之间和同一实验个体之间度量值的变异。通过使用携带微生物背景明确的动物（如，SPF动物），可使这类变异减少到一定程度。,更换饲养场所的实验动物,，,至少要经过一周的时间动物才可能达到一种新的稳定的生理状态。动物到达一个新的地方，涉及物理、化学、微生物等环境的改变，不管这个环境是暂时的还是长久的，新环境会增加个体间度量值的变异。因此，有人建议，根据动物实验研究的类型，做好实验计划，从外面购买的动物使用前在新的环境最好有3周的适应期。,虽然一些国家对实验动物的饲养密度有具体规定，但在屏障系统中，如果多采用顶送风、四角回风的通风系统，动物笼架1.5m高的位置上可能比0.5m位置动物饲养盒内温度高出几度。动物单独饲养饲料的摄入量比群体饲养明显增多，原因是群体饲养的动物挤作一团，减少了身体热量的丢失，结果造成能量需求的减少。动物饲养盒内的微环境（micro-environment）包括：动物数量、相对湿度、垫料类型等，都是动物实验应该考虑的可能引起度量值发生变异的因素。,图展示了水杨酸盐（salicylate）、麻黄素（ephedra）的毒性和环境温度的关系。图中LD（lethal dose）指致死量，单位是g/kg体重。水杨酸盐的毒性同室内温度之间呈“U”形曲线的关系，很值得注意。和室温呈类似关系的还有阿托品（atropin）、氯丙嗪（chlorpromazine）和戊巴比妥（pentobarbital）等。麻黄素的毒性随室内温度的增长而增长。因此，,为了减少实验间药物毒性度量值之间的变异，实验室温度应该标准化。,在实验过程中，饲养条件不同的动物应被均等的分配到对照和实验组中去，这样在对照组和实验组群体之间的处理就不会因饲养条件的不同而产生偏倚。动物房内部的局部环境条件应该在不同的实验中保持一致。理想的状况是所有的环境因素从一个实验到另一个实验保持一致。,当使用实验动物进行实验时，环境因素标准化是必要的。理想、标准化动物实验环境要考虑结合动物福利和工程学原理，虽然有时这样做并不能减少实验内度量值的变异。,实施动物实验标准化时，应该标准化对动物的健康没有任何负面影响。在力求标准化时，应考虑到动物生理和行为需求，否则，标准化可能达不到可预期目标。一般来说，研究人员从供应商那里获得动物，不可能在实验前决定或控制标准化，但是，可以要求供应商提供动物明确的遗传质量和微生物控制等级等方面的资料，在设计动物实验时参考。,从原则上讲，设计好动物实验后，动物实验的结果正确与否取决于实施实验的条件（动物、环境因素等）。对于常规的验证性实验（如，疫苗活力的检测）不成问题。然而，一些实验可能需要从得到的实验数据总结出结论。实验的标准化意味着是对实验条件的一种限定。所以，实验的标准化不能与总结推断结果相提并论。,即使认为该动物的确能代表某一种特定动物群体，实验的结果也只限定这个动物群体（相同的品系、相同的性别、相同的体重）和限定的条件（生物、理化、环境特性）。当从实验动物身上得到实验结论要推断到其他物种身上（甚至人）时，问题就会变得更为复杂。这里必须注意：从动物实验结论到常规结论的推断，特别是以一种动物到另一种动物时，由于采用标准化动物实验，有利于限定概括出的实验结果，所以，标准化对于实验结果推断也很重要的。,实验动物的历史和应用,一、实验动物的历史,人类饲养小鼠的历史至少有3000年。,18世纪中国和日本饲养的宠物小鼠传到了欧洲，与当地小鼠杂交，成为现代实验小鼠的鼻祖。,早在1664年，Robert Hooke就用小鼠研究空气的特性。,1902年，美国哈佛大学的William Castle揭开了近代在生物医学研究领域中饲养和使用小鼠的序幕。,1909年Clarence C.Little 培育成功世界上第一个近交系小鼠品系DBA。,1906年美国农业部畜牧局的Rommel开始了豚鼠近交实验,最新统计，全世界已经培育成功近交系小鼠品系478个、近交系大鼠品系234个,访问，informatics.jax.org/extermal/festing可以查阅目前全世界培育成功的近交系小鼠和大鼠的资料。,二、实验动物的使用,据粗略估计，,1960,年，全世界科学研究中使用的脊椎动物大约,3000,万只，到了,1970,年，这个数字翻了几番，估计,1,2,亿之间。,总的来说，从20纪初到70年代初期，实验动物的使用量急剧上升，70年中后期处于稳定时期。从80年代以后，逐步下降，目前又处在比较平稳的时期。,英国动物使用情况：,图 1-1 1970-2000年，英国科学研究中使用的动物的数量,加拿大,1975,年和,1992,年使用动物的数量和主要种类,图,1-2,加拿大,1975,年和,1992,年使用动物的数量和主要种类,从科学研究中使用的动物的种类来看，,80%,以上是啮齿类实验动物。,图,1-3 2001,年英国在生物医学研究使用各种动物中所占的百分比,几十年来，生物医学研究中使用动物的数量不但逐步减少，而且使用实验的种类也在明显的发生变化。,1975,年和,1992,年相比，加拿大在其它动物使用量大幅度减少的情况下，鱼类使用了增加了近,4,倍，在很多研究领域（如，毒理学），鱼类代替了哺乳动物（图,1-2,）。,虽然生物医学研究使用动物总的数量在减少，但动物实验研究的强度和力度不但没有减弱，反而在加强。其中，一个明显的特征是，转基因动物的用量急剧增加。,图,1-4,英国,1990,年和,2000,年科研中使用转基因和非转基因比较,另一个特征，多数国家资助动物实验研究的经费逐年增加。,图 1-5 1983年到1989年，美国NIH资助的科研项目中使用动物和人类进行研究的基金数额,从世界范围内来看，实验医学研究中使用动物的数量经过上个世纪早、中期大幅度增加以后，逐渐回落，目前处于相对稳定时期。但总的趋势是：高等动物使用量下降、低等动物使用量增加；传统动物使用量下降，遗传修饰动物使用量增加；还有，使用动物的种类在扩大。,实验动物的管理,一、动物实验引发的争议,出现了一对矛盾：动物实验研究的科学家和所谓的“动物权利”组织、,“,动物解放阵线,”,等极端的动物保护主义者之间。,我们认为，只有使用实验动物才可能继续进行生物医学研究和开发安全有效的药物，有益于人类和动物的健康。在动物实验研究中，我们也强调要重视保障动物福利。,二、动物福利和动物实验的替代,1 实验动物的福利,动物作为一种生命形式，同人类一样有着基本生存需要和高层次的心理需要。动物具有各种感觉能力，也有丰富的情绪和才能。如，情爱和爱心、记忆、专注和好奇、模仿以及推理等，有的甚至十分发达。作为与人类共存一个相互依赖的生态系统里的动物，应该受到人类的关心和尊重，平等考虑它们的利益，即动物福利。,在动物实验研究中，动物福利更加强调保证动物健康、舒适生存的外部条件。当外界条件无法满足动物的生理需求时，就标志着动物福利的恶化。,23Rs理论,3Rs是Reduction(减少)、Replacement(替代)和Refinement(优化)的简称。具体的讲3Rs是指在科学研究中，使用较少量的动物获取同样多的实验数据或使用一定数量的动物能获得更多实验数据的方法；使用其它方法而不用动物所进行的实验或其他研究课题，达到与动物实验相同的结果；通过改进和完善实验程序，减轻或减少给动物造成的疼痛和不安，改善动物福利的方法。,3Rs是从动物实验的角度来谈如何善待、减少和替代实验动物的问题。,实验动物的管理,管理实验动物目的在于生物医学教学、研究、测试等活动中能够人道的对待实验动物，使动物的福利得到保障，提高生物医学研究的质量。,实验动物管理可以简单的分为两个层次：,第一个层次是国家或地方政府颁布的强制性法律、法规。,第二个层次是一些学术团体、基金组织、科研单位（研究所、大学）制订的管理办法以及动物实验研究志愿遵守的规章制度。,1876年英国颁布了全世界第一部与动物实验有关的法律防止虐待动物法。,1960年美国联邦政府颁布动物福利法，1970、1976、1985、1990年重新修订。,1985年，修订动物福利法并颁布了改善实验动物标准法。,1986年，欧共体（European community）外长会议通过了各成员国必须执行的动物实验和其它科学研究中使用的脊椎动物保护条例,我国政府1987年颁布了实验动物管理条例,1994年10月1日 颁布了实验动物微生物学和寄生虫学监测等级(啮齿类和兔类)、哺乳类动物的遗传质量控制、全价营养饲料、环境及设施等4个强制性国家标准，实验动物沙门氏菌检验方法等44个推荐性标准,2001年又对这些标准进行修订、增补,1997年国家科技部颁布了实验动物质量管理办法,1998年卫生部颁布了医学实验动物管理实施细则,动物实验的申请,按照正常管理程序，任何人进行动物实验研究时，都应该到本单位或主管部门的IACUC领取“动物实验申请书”，认真填写、签名、盖章后，再送到IACUC，等IACUC正式批准后，才能开始实验。,