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电喷雾质谱在非共价蛋白复合物研究中的应用

1. 前言
质谱作为一种分析方法，长期以来一直用于小分子化合物的结构分析。直到80 年代末电喷雾电离质谱（electrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS）和基体辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS）两种“软电离（soft ionization）”质谱的出现，才将质谱的分析范围扩大到生物大分子的结构分析。在生物界，生物分子的非共价特殊作用是分子辨认的基础。因此，非共价复合物的检查在生物学上是一个重要的研究课题。虽然MALDI-TOF的较高灵敏度和Mr表征范围对于测定生物大分子物质优于ESI质谱，但是它在检测非共价复合物的应用上却受到供试品制备条件的限制[1]刘益华，徐俊福.基质辅助激光解吸飞行时间质谱在生物大分子中的应用.中国生化药物杂志.2023，25(3)：192-193。而ESI-MS对蛋白质复合物的研究在样品用量少、快速的情况下可得到可靠的数据和较多的信息。由于其具有灵敏度高、快速和质量精确度高的优点，复合物的化学计量比可以很容易地推导出。通过改变源的锥孔（cone）电压、改变溶液的pH 值和进样毛细管温度，可以比较不同化合物与蛋白质的亲合力的大小[2]Parmanik BN, Bartner PL, Mirza UA, et al. Electrospray ionization mass spectrometry for the study of non-covalent complexes: an emerging technology[J]. J Mass Spectrom,1998, 33(10):911-920。对非共价键复合物进行部分酶解或完全酶解，还可以拟定小分子与蛋白质的结合位点[3]Millar AL, Nicholas AC, Jackson NAC, et al. Rapid analysis of epitope-paratope interactions between HIV-1 and a 17-amino-acid neutralizing microantibody by electrospray ionization mass spectrometry[J]. Eur J Biochem,1998,258(1):164-169.。可见，ESI-MS可广泛用于研究蛋白质非共价键复合物。到目前为止，用ESI-MS观测到的不同的非共价键复合物涉及蛋白质-蛋白质［4］Ogorzalekloo RR, Goodlett DR, Smith RD, et al. Observation of a noncovalent ribonuclease S-protein S-peptide complex by electrospray ionization mass spectrometry[J], J AM Chem Soc,1993,115(10):4391-4392，蛋白质-配体［5］Robinson CV, Chung EW, Kragelend BB, et al. Probing the nature of noncovalent interaction by mass spectrometry. A study of protein-CoA ligand binding and assembly[J]. J Am Chem Soc,1996,118(36):8646-8653，蛋白质-寡核苷酸［6］Light-Wahl KJ, Springer DL, Winger BE, et al. Observation of a small oligonucleotide duplex by electrospray ionization mass spectrometry[J]. J Am Chem Soc, 1993,115(2):803-804.和蛋白质-双链DNA［7］Cheng XH, Morin PE, Harms AC, et al. Mass spectrometry characterization of sequence-specific complexes of DNA and transcription factor PU.1 DNA binding domain[J]. Anal biochem,1996,239(1):35-40.及蛋白质-金属离子等［8］Hu P, Loo JA. Gas-phase coordination properties of Zn2+,Cu2+,Ni2+, and Co2+ with histidine -containing peptides[J]. J AM Chem Soc,1995,117(45):11314-11319.。
2. 电喷雾质谱（ESI-MS）的基本原理及特点
其原理是[9,10] 岳贵花，许崇峰，卞利萍等.电喷雾质谱在非共价蛋白复合物研究中的应用. 分析化学学报,2023,16(6):495-502. 王红霞，杨松成.蛋白质非共价复合物的电喷雾质谱研究进展.药学学报,2023,36(4):315-320.
:在高压电场下，少量的液体在雾化气的作用下形成溶剂化离子飞向电极，在这一过程中，受外界条件作用（如逆向干燥气流），逐渐脱溶剂化以致最终溶质离子从该溶剂化离子中解吸出来形成带多电荷分子离子进入质谱。电喷雾电离的特点是蛋白质等生物分子能产生多电荷离子，使质荷比减少到多数质谱仪都可以检测的范围，因而大大扩大了分子量的分析范围。分析物离子的真实分子量可以根据质荷比及所带电荷数计算，一般由计算机软件完毕。电喷雾质谱可充许有少量的盐和缓冲液，但盐和缓冲液的存在会使仪器的灵敏度减少。电喷雾质谱的优点是可以方便地与多种分离技术联用，如液质联用和毛细管电泳－质谱联用等。
3． 喷雾质谱（ESI-MS）在蛋白质非共价键复合物研究的应用
自1991年Ganem[11]Ganem B, LI YT, Henion JD. Detction noncovalent receptor-ligand complexes by mass spectrometry[J]. J Am Chem Soc, 1991,113(16):6249-6296.等最早应用电喷雾质谱研究细胞浆中受体蛋白FKBP12及其配体FK506和rapamycin的非共价键复合物以来，该技术被越来越多的学者所应用。有关蛋白质－配体－以及组成蛋白质的各亚基间的非共价互相作用的文献报道很多，Joseph[12]Joseph A Loo. Mass Spectrom. Review[J],1997,16:1.列出了近年来ESIMS在这一领域的研究进展。

3.1 蛋白质－蛋白质互相作用
很多蛋白质在体内实验中互相作用很强，而相同蛋白质寡聚体或其他形成功能蛋白复合体互相作用很弱。ESI-MS也许可以通过质量的测定对蛋白质－蛋白质复合体的结构供应直接、明确的信息。与其他光谱技术相比，这种技术有很多优势，比如，测定余因子依赖蛋白质-蛋白质互相作用[84]。
4-草酸丁烯酸酯异构体酶四级结构是第一次采用ESI-MS进行分析的寡聚蛋白[86]。根据分子筛色谱和超速离心，认为4-草酸丁烯酸酯异构体酶为五倍体[87]。X－射线衍射和质谱明确显示此蛋白质为一个41kDa的六倍体(86,88)。另一方面，四个单点突变4-草酸丁烯酸酯异构体酶只能形成单体蛋白质离子。这些数据说明自然蛋白具有寡聚行为，残基对保持六倍体结构有重要作用。
在Standing等研究的基础上，其他研究小组也开始用ESI-MS分析已知和未知寡聚蛋白质复合体的化学计量式。在proteasome催化蛋白（89,90），chaperone complex GroEL[91]，和各种血色素[92-96]的研究中均得到有趣的结果。ESI-MS实验证明GroEL由两个七倍体环组成，并非共价结合14亚单元，总分子质量为800kDa[91]。GroEL在拥有co-chaperoneGroES的前提下才具有活性。进一步用MS研究GroES可变部分与模型底物helix D的互相作用[97]。结合荧光交联实验得到甚至在GroEL四倍体上也有GroES及底物蛋白明显，至少式部分结合的位点。
根据MS研究，在大多数哺乳动物系统中血色素以分子量约为60kDa的四倍体存在，在低浓度下则很也许以二倍体存在。MS广泛用于研究血色素的结构。比如，镰刀红血球患者组织血液中的血色素S和胎儿血色素[98]。此研究总结了镰刀红血球病不均匀血色素混合物和其他四聚体的定量测定。所以，血红素亚基的非共价结合可用ESI-MS进行研究。质谱显示患者和胎儿血液均具有包含α2β2、α2γβ两种杂交体的完整血红素四倍体。根据不均匀血色素杂和物质量的测定，发现在患者血液中有一种平均质量为64.6kDa独特的四倍体标记蛋白。
另一个优秀的研究显示MS可用于甲状腺传递系统寡聚蛋白的分析[99]。四倍体人类蛋白质reansthyretin通过与维生素A结合蛋白非共价结合传递荷尔蒙甲状腺素。Transthyretin被认为淀粉纤维的组成成分，并与一些疾病如Alzheimer’s，二型糖尿病和遗传性海绵状组织脑病有关。在正常情况下，transthyretin运送甲状腺素和维生素A，但是天然型展开和单点突变分别导致老年系统淀粉样变性病和家族淀粉质神经病。Transthyretin四倍体的分裂被认为是形成淀粉状纤维的第一步[100]。McCammon等用MS实验了18种这一过程的克制剂(99)。测定了这些配体结合，稳定四倍体结构，与transthyretin复合体互相作用及与自然配体甲状腺素竞争的能力。通过对具有六个蛋白质亚基，两个维生素A分子和两个合成配体（四个transthyretin和两个维生素A结合蛋白）的多面十组分复合物的研究发现配体的加入不会克制transthyretin与维生素A的结合。甲状腺素与作为探针的人工合成配体的作用特点则不同样。研究积极、悲观与无作用机理；并证明人工配基对甲状腺素的结合产生悲观影响。Loo等[]对ADH(Alcohol Dehydrogenase)锌金属酶在乙醛、乙醇互变中的作用进行了研究，表白酵母及哺乳动物的ADHs都是均质的，在这个过程中，仅有25％的残基参与互变。在ESIMS分析蛋白质亚基结构过程中，溶液的pH及离子源的条件都很重要，在不同pH值下，蛋白质以不同数目的亚基聚集体存在。这对我们研究蛋白质性质具有重要意义。Standing等[]Fitzgerrald M C, Chermushevish I, Standing K G, et al. Acad. Sci. USA[J], 1996,93:6851.采用ESI-TOF-MS对4OT酶的低聚结构进行分析、测试，结果表白在溶液中其以六聚体存在，这和以往的X-Ray衍射结果一致。对Silurus Asotus Roe Lectin(SAL)的ESIMS测定表白SAL的单体分子量为31 750Da，而沉淀平衡法测定的分子量为95 200Da。由此可以说明该蛋白质在溶液中以三聚体的形式存在。经基质辅助激光解吸飞行时间质谱测定验证了这一推断[]Murayama K, Taka H, Kaga N, et al. Anal. Biochemistry[J], 1997,247:319.。Lafitte对钙调节蛋白在溶液中及变性条件下的蛋白质聚合体的研究与超离心测定结果一致[36]Lafitte D, Heck A J R, Hill T J, et al. Eur. J. Biochem[J]. , 1999,261(1): 337.
3.2 蛋白质和配体
MS用于配体-蛋白质非共价作用的研究最初关注于完整亚铁血红素-肌血球素化合物[40]及完整复合FK结合蛋白（FLBP）[61]，后者为免疫克制结合蛋白，可与免疫克制剂FK506、rapamycin结合。非共价ESI-MS可以测定蛋白质-配体化合物的分子质量，所以它可以精确的区分结合在同一位点上的两个接近的相关配体。Ras蛋白结合GDP和GTP的研究有力的证明了这一点[73,74]。ras蛋白为细胞生长调整蛋白；结合GDP后活性丧失。因此，研究细胞生长过程对于区分GDP-ras蛋白与GTP-ras蛋白非常重要。根据分子质量的差别，以上两种非共价结合物很容易通过ESI-MS区别出来（Mw GDP-ras=19295Da；GTP-ras=19375Da）。
ESI-MS不仅可用于拟定配体的质量及其结合化学计量，它还可用于估计溶液中不同蛋白质-配体的相对强度[75-77]。杨松成等[]王红霞，张学敏，杨松成等.中国科学（C辑），2023，32（4）：355－360.系统地用电喷雾质谱研究了重组人受体蛋白FKBP12(rhFKBP12)和其小分子神经生长促进剂配体的非共价键互相作用, 从52 个化合物中筛选出3个有非共价键结合的化合物000107， 000308 和A2B12， 并通过竞争实验测定了它们与rhFKBP12 的结合位点和相对结合强度。其中000107 和000308 与rhFKBP12 非共价键复合物的X 晶体衍射结果与ESI-MS 的结果吻合。 小分子化合物000308在鸡胚背根神经节无血清培养实验中有很好的促神经生长活性, 表白ESI-MS 可以在分子水平上为新药筛选提供依据, 是很有发展前程的新方法。
Rostom等[80]发现58kDa的外周胞质氨基酸受体蛋白OppA可与11个不同性质的多肽发生作用。将具有2，3和5个氨基酸残基的多肽加入到OppA中。ESI-MS实验证明，OppA与三肽、二肽均可形成化合物，其中前者的的亲和力较大，而与五肽或N-末端乙酰化后的三肽无法形成化合物。具有单一D氨基酸残基的三肽与天然OppA无法结合。对氨基酸结合比例和低能量MS条件下的自由蛋白的分析与液相Kd测定的结果相似。此研究得到的结果很好的反映了这一蛋白不管序列可包含细胞二肽和三肽的生理特性。
3.3 蛋白质和金属
金属离子对酶的催化性及结构稳定性都非常重要，同时对许多蛋白质的生物功能也具有重大的作用。研究金属离子与蛋白质互相作用的方法有许多（如吸取光谱、园二色谱、NMR等）。近年来采用-./*.研究两者的互相作用也取得了很大进展。
结合金属离子后，根据ESI-MS测得的蛋白质质谱的变化可得到直接、准确金属与蛋白质结合的化学计量数据[66-68]。等用ESI-MS估计Ca2＋结合蛋白（calbindin D28k）的金属结合化学计量式[69]。传统方法认为calbindin D28k具有3－6个Ca2+结合位点[70-72]。ESI-MS最终显示一个calbindin D28k分子可结合4个Ca2＋离子[69]。无Ca2＋蛋白质和结合Ca2＋后质量相差151Da（4×38＝152）。Ca2＋离子的质量为40Da，而质谱得到每增长一个Ca2＋质量增长38Da。这是由于Ca2＋及二价金属离子一般在结合时会替代两个质子（2Da）。Witkowska[]Witkowska HE, Shackleton CHL, Dahlman-Wright K, et al. J. AM. Chem. Soc[J]., 1995,117:3319研究了糖皮质激素受体的DNA结构域与Zn2+、Ca2+结合的特性。结果表白糖皮质激素受体具有2个锌指，每4个半胱氨酸残基与一个Zn2＋作用，在CysCysHisCys型锌指结构中二个巯基各脱去一个质子后与Zn2＋结合。近年来，对钙调节蛋白与金属离子Ca2＋，Cd2＋的结合，以及钙调节蛋白-蜂毒素- Ca2＋的研究证实ESIMS已逐渐成为探测蛋白质-金属离子复合物的重要工具之一[]Chazin W, Veenstra TD. Rapid Communications In Mass Spec[J]., 1999,13(6):548. Veenstra TD, Tomlinson AJ, Benson L.J. Am. Soc. Mass Spectrom[J]., 1998,9(6):580.

3.4 蛋白质和核苷酸
最初ESI-MS 的研究研究之一是将ds-DNA与真核tRNA因子（PU1）DNA-结合位点连接起来（81）。PU.1-DNA结合位（DBD）蛋白与天然型目的DNA序列混合物产生的ESI-MS谱图仅出现1:1蛋白质-ds-DNA化合离子和自由ds-DNA。当序列不同的PU.1-DBD蛋白质，天然目的蛋白和突变目的蛋白混合时，仅得到与天然蛋白1:1的化合物，这与凝胶电泳实验的结果一致。这些数据充足说明PU.1蛋白质DNA化合物不仅仅是由碱性氨基酸与负离子磷酸DNA骨架作用导致的。并且，数据突出蛋白质之间特定的作用序列。
Potier等用相似的方法测定蛋白质-DNA化合物[82]。ESI-MS用于研究了trp apo-repressor(TrpR)，色氨酸及它们特定的操纵子DNA序列的互相作用。Trp operator/repressor是生物化学领域研究最多的翻译系统[83]。结合色氨酸后，repressor protein改变构形，并使其得以结合于其操纵DNA序列，从而克制其基因的表达。在5mM醋酸铵中，TrpR为部分展开的单体。结合TrpR必须在具有两个对称排列CTAG的21个碱基对DNA，同时形成1:1的同型二聚体。此外，为了鉴定TrpR与其目的蛋白结合的特异性，它们做了竞争实验。此实验中，他们将蛋白质与相同浓度三种不同DNA混合，分离出的CTAG序列的分别为2，4，6bp。仅4bp的DNA序列可与TrpR作用。这个实验表白，ESI-MS也可用于蛋白质-DNA化合物作用序列的鉴定。
虽然ESI在蛋白质-DNA化合物中的应用相对较新，这两个报道说明MS可以提供精确的结合化学计量数。对于一个特定的DNA序列来说，可以拟定某一蛋白与其发生亲和作用的特点。但是，在分析蛋白质－DNA化合物时，DNA磷酸骨架的极性过高。碱金属离子与寡核苷酸极易发生紧密结合，这样会使峰宽加大，并使质量测定发生偏差。然而，目前。MS的分辨率对于钠加合物来说还是足够的。
3. 展望
在现今的生命科学发展中,以快速、灵敏的检测方法来提供分子间互相作用的信息及生物大分子的结构信息将为我们从分子水平上结识生命现象提供极大的帮助。以生物质谱如ESIMS、MALDIMS等参与的分析、测试手段方法将在这片新的科研领域中越来越显示其重要性。
从前面的讨论中我们已知道在非共价复合物的研究中，需要对实验条件进行细致的设计、安排。虽然已有多篇关于采用MS研究非共价键和复合物的研究报道，但每一具体的样品仍需采用不同的条件及方法R同时由于经验的局限性>在解析质谱谱图中仍有一定的难度，这需要广大的科研工作者进一步的努力。MS并不能为我们提供物质结构的直观图像，因此需要我们根据所测大分子的各片段质量数进一步推测。完全依靠MS分析样品分子结构及分子间互相作用还是有一定的难度。但是它提供了NMR、X-Ray衍射等方法所不能测得的信息。对我们的前沿研究仍具有重大意义。我们有理由相信，在未来的分析中将会建立起一系列基于MS参与分析、研究的新的仪器分析方法。

Title: Electrospray-ionization mass spectrometry for protein conformational studies
Author(s): Grandori R
Source: CURRENT ORGANIC CHEMISTRY 7 (15): 1589-1603 OCT 2023
Document Type: Review
Language: English
Cited References: 146      Times Cited: 1       
Abstract: The possibility to study large molecules and their non-covalent interactions by mass spectrometry (MS) has opened novel ways to investigate protein folding and binding reactions. MS can be applied to protein conformational studies in two conceptually different ways. One approach uses MS to monitor mass changes produced by conformation-sensitive reactions, such as hydrogen/deuterium (H/D) exchange, alkylation and radiolysis. The second approach directly exploits the conformation dependence of the charge-state distributions (CSDs) of the multiply charged protein ions produced by electrospray-ionization (ESI). This review focuses on the information that has been provided by the latter kind of studies. An attempt is made to summarize and discuss the available evidence about the mechanism underlying this technique and its possible applications. The results of the studies described here include equilibrium and kinetic characterization of protein folding transitions and detection of folding intermediates. The case studies of myoglobin (Mb) and cytochrome c (cyt c) are discussed in particular detail. The unprecedented advantages offered by MS in the analysis of heterogeneous samples can now be applied to the study of dynamic systems involving different conformational states.
KeyWords Plus: CHARGE-STATE DISTRIBUTIONS; PROTON-TRANSFER REACTIVITY; MOLTEN-GLOBULE STATE; CYTOCHROME-C IONS; GAS-PHASE; STRUCTURAL CHARACTERIZATION; DYNAMIC CHARACTERIZATION; FOLDING INTERMEDIATE; THERMAL-DENATURATION; HYDROGEN-EXCHANGE
Addresses: Grandori R (reprint author), Johannes Kepler Univ, Inst Chem, Altenbergerstr 69, Linz, A-4040 Austria
Johannes Kepler Univ, Inst Chem, Linz, A-4040 Austria
Publisher: BENTHAM SCIENCE PUBL LTD, PO BOX 1673, 1200 BR HILVERSUM, NETHERLANDS
Subject Category: CHEMISTRY, ORGANIC
IDS Number: 730EX
ISSN: 1385-2728
Title: Electrospray ionization mass spectrometry in the study of biomolecular non-covalent interactions
Author(s): Veenstra, Timothy D.
Source: Biophysical Chemistry 79 (2) : 63-79 June 7, 1999
Language: English
Medium: print
Abstract: In the past mass spectrometry has been limited to the study of small, stable molecules, however, with the emergence of electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) large biomolecules as well as non-covalent biomolecular complexes can be studied. ESI-MS has been used to study non-covalent interactions involving proteins with metals, ligands, peptides, oligonucleotides, as well as other proteins. Although complementary to other well-established techniques such as circular dichroism and fluorescence spectroscopy, ESI-MS offers some advantages in speed, sensitivity, and directness particularly in the determination of the stoichiometry of the complex. One major advantage is the ability of ESI-MS to provide multiple signals each arising from a distinct population within the sample. In this review I will discuss some of the different types of non-covalent biomolecular interactions that have been studied using ESI-MS, highlighting examples which show the efficacy of using ESI-MS to probethe structure of biomolecular complexes.
Address: Veenstra, Timothy D.; Environmental and Molecular Sciences Laboratory, Pacific Northwest National Laboratories, MSIN K8-98, Richland, WA, 99352, USA
ISSN: 0301-4622
MAJOR CONCEPTS: Biochemistry and Molecular Biophysics; Methods and Techniques
CONCEPT CODE: 10050, Biochemistry methods - General; 10060, Biochemistry studies - General; 10502, Biophysics - General
Methods and Equipment Data: