8外源化学物致突变作用8-2.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第七章,外源化学物致突变作用,1/57,案例,3,分析讨论,镰刀型细胞贫血是遗传物质,DNA,中血红蛋白基因序列中一个,CTT,变成,CAT,，即发生基因颠换，血红蛋白,链中,N,端第六位氨基酸由,Glu,变为,Val,，血红蛋白分子发生遗传缺点，以至产生病变。这种疾病能够遗传。,经过这个案例，首先了解从碱基改变，到编码产物改变，再到表现型改变最终到健康效应出现之间因果关系。另首先要认识到基因突变发生会引发严重健康危害。,2/57,第四节 机体对致突变作用影响,3/57,遗传物质在外源性原因损伤仍能代代相传原因：,DNA,可执行高保真度复制，对复制中错误能及时修复，从而到达高度保真。,细胞能够经过对,DNA,损伤修复而保护亲代,DNA,链，使之防止因为内、外各种原因损伤而发生改变。,4/57,一、,DNA,损伤修复,（一）直接修复：依赖酶作用。,光复活：,依赖光过程，经过,光裂合酶,切下,DNA,上嘧啶二聚体，将毗连嘧啶接回原结构上。能够,完全修复,紫外线诱发嘧啶二聚体，使其在原位上恢复为单体。,“适应性”反应：,经过烷基转移酶修复,DNA,烷化损伤，保护细胞免受烷化剂毒性影响。,5/57,（二）碱基切除修复,DNA,糖基酶,作用于受损,DNA,，,识别并切除损伤碱基,，经过切断碱基与脱氧核糖连接键，使受损碱基脱落，留下一个无嘌呤或无嘧啶,AP,位点。,AP,内切酶,将,DNA,链切断，由聚合酶和连接酶完成修复过程。,碱基切除修复是细胞对碱基氧化损伤主要防御系统。,6/57,（三）,核苷酸切除修复,使细胞含有从,DNA,上移除较大损伤。,全部生物体最常见修复机制。基本能够修复全部种类,DNA,损伤。,过程：内切酶，,损伤识别；损伤两侧切除损伤链；切除寡聚核苷酸；修复合成填补产生缺口；,DNA,连接酶封闭，恢复原有,DNA,序列。,7/57,（四）双链断裂修复,未修复双链断裂开启,DNA,损伤反应系统，使细胞阻滞于周期某一期或诱发细胞凋亡。,不是修复，是一个耐受过程，以容忍损伤继续存在和高突变率情况来换取细胞继续生存耐受过程。,8/57,（五）交联修复：,当细胞内发生,DNA,链内交联，会造成双链断裂，机体开启无误交联修复或易误交联修复。,9/57,小结,修复结果不全是有益。,修复路径是各种。,修复与突变不可分。,损伤修复突变,10/57,二、遗传原因对致突变作用影响,（一）代谢酶遗传多态性,1,、氧化代谢酶,芳烃羟化酶：催化多环芳烃等致癌物活化。,2,、酯酶,环氧水化酶：活化酶，参加苯并（,a,）比代谢为终致癌物。,3,、谷胱甘肽硫转移酶,缺乏易患肺癌,11/57,（二）修复功效个体差异,修复酶多态性造成机体对损伤反应不一。,1,、,O,6,甲基鸟嘌呤,DNA,甲基转移酶：,功效：,恢复碱基原有配对性。,缺乏或活性降低：,肿瘤发生,2,、聚（二磷酸腺苷核糖）多聚酶,：,功效：,氧化损伤修复方式，对外来原因造成基因突变和肿瘤发生可产生抑制或促进作用。,12/57,小 结,遗传原因是化学毒物作用靶部位，是决定化学毒物毒作用性质和强度一个主要原因。,遗传原因对致突变作用影响研究，是预防和治疗肿瘤新思绪。,13/57,第五节 观察外源化学物致突变作用基本方法*,14/57,致突变试验应用,中国预防医学博士张学明,:,煎炸鱼中合有强致癌物杂环胺。,杂环胺形成量主要受煎炸、烤温度影响，其次是煎烤时间。煎炸温度小于,200,，杂环胺形成量就极少；假如煎炸温度超出,200,，煎炸时间少于,2,分钟，杂环胺形成量也极少；在煎炸鱼外面挂上一层淀粉糊再炸，也能预防杂环胺形成。,美国加州科研人员发觉，高温烹调或油炸肉食中合有突变源，对经过高温烹调牛肉、鸡、鱼等进行检验，结果测出,10,种致癌化合物，这次研究证实，突变源不是因为炭火等热源将肉烧糊所致，而是肉食本身成份在加温,200,以上时产物,。,15/57,检测化学物致突变性目标：,判定生殖细胞和体细胞致突变物；,预测潜在致癌物,环境致突变物监测与评价。,16/57,一,.,观察项目标选择,（一）观察效应终点类型,遗传学终点,(genetic endpoint),：,基因突变和染色体畸变检测可直接反应外源化学物致突变性，是评价化学物致突变性唯一可靠方法。有许多试验所观察到现象并不反应基因突变,染色体畸变和染色体分离异常,而仅反应致突变过程中发生其它事件。所以，将试验观察到现象所反应各种事件统称为遗传学终点。,包含：基因突变，染色体畸变，染色体组畸变，,DNA,原始损伤,17/57,（二）成套观察项目,1.,标准,选择遗传毒性试验应包含每一类型遗传学终点。,应包含各种进化程度不一样物种,如原核细胞,低等和高等真核细胞。,体内试验与体外试验配合。,18/57,2.,HIC(1997),对于药品遗传毒性评价提议试验组合为：,细菌基因突变试验,体外,哺乳动物细胞染色体畸变试验或体外小鼠淋巴瘤细胞,tk,试验,；,体内啮齿类造血细胞染色体损伤,试验,；,对标准致突变试验组合结果深入研究时，能够选择其它一些试验，如,DNA,加合物测定、,DNA,链断裂检测、,DNA,修复试验等。,19/57,二、惯用致突变试验,细菌回复突变试验,微核试验,染色体畸变分析,姐妹染色单体交换试验,果蝇伴性隐性致死试验,显性致死试验,程序外,DNA,合成试验,单细胞凝胶电泳,20/57,(,一,),细菌回复突变试验,Ames,试验*,是利用突变体测试菌株，观察受试物能否纠正或赔偿突变体所携带突变改变，判断其突变型。,惯用指示菌株：,鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌,。,广泛应用鼠伤寒沙门菌突变试验。,21/57,(,一,),细菌回复突变试验,Ames,试验*,1.,原理：,是人工诱变突变株在组氨酸操纵子中有一个突变，突变菌株必需依赖外源性组氨酸才能生长，而在无组氨酸选择性培养基上不能存活。致突变物可使其基因发生回复突变，使它在缺乏组氨酸培养基上也能生长。计算诱发回复菌落数即可判断化学毒物致突变性。,22/57,2.,惯用菌株：,鼠伤寒沙门菌组氨酸缺点型突变株为指示微生物。,当前推荐使用,TA100 TA102 TA97 TA98,为增强对诱变物敏感性加入一些附加突变：,试验中可供选取测试菌株有各种，所携带突变在不一样基因中，各有不一样特征，有测定碱基置换，有测定移码突变，有二者都可测定，依据试验目标配套选择。,23/57,(,一,),Ames,试验,3,.,方法：,点试法：用作定性试验，适合用于短期大量筛选,阳性,阴性,表层培养基指示菌,S,9,培养,48,小时,受试物,10l,24/57,平板掺入法：标准试验，用作定量测定,培养,48,小时,阳 性,阴 性,表层培养基指示菌,S,9,受试物,25/57,(,二,),微核试验,(micronucleus test,MNT),观察受试物产生微核发生率或,有微核细胞率为观察指标检测,化学物染色体损害能力试验，,DNA,断裂剂，非整倍体诱变剂。,微核,（,micronucleus,）,：,染色体或染色单体无着丝点断片或因纺锤体受损伤而丢失整个染色体，在细胞分裂后期仍留在子细胞胞质内，单独形成一个或几个规则次核，包含在子细胞胞质内，比主核小。,26/57,正常细胞、微核细胞,27/57,正常细胞、微核细胞和核异常细胞,指示正常细胞；指示微核细胞；指示核异常细胞（,2.5100,）,28/57,骨髓多染红细胞微核试验,大多数类型细胞都可形成微核，但有核细胞胞质少，微核与正常核叶及核突起难以判别。,常规：骨髓多染红细胞微核试验,多染红细胞是成红细胞发展为成熟红细胞时，主核已排出，微核仍保留在细胞质中，成为多染红细胞（,polychromatic erythrocytes PCE,）,这些细胞保持其嗜碱性约,24,小时，然后成为正染红细胞，并进入外周血。,计数骨髓有微核多染红细胞率可判断受试物对骨髓细胞染色体损伤作用。,29/57,骨髓细胞微核试验不足,一些化学物在骨髓难以抵达有效浓度。,骨髓中,SCE,是,动态平衡，其不停成熟为红细胞，红细胞又衰老死亡。,化学物毒物主要在肝脏活化，其活化中间产物可能在抵达骨髓之前消失。,仅观察体细胞其结果外推其它组织应慎重。,30/57,微核试验进展,体外微核试验,：,中国仓鼠肺细胞,/,中国仓鼠卵巢细胞,/,中国仓鼠成纤维细胞，易于操作和控制受试物浓度。,外周血微核试验,：,可能成为人群观察化学毒物遗传毒性一个伎俩。,双核细胞法,：,提升微核灵敏度。,免疫荧光染色法、荧光原位杂交,：,灵敏度高，还可判断起源（断片还是染色体）。,31/57,(,三,),染色体畸变分析,chromosome aberration assay,观察,染色体形态结构和数目改变,，又称细胞遗传学试验。,观察：,用显微镜检验细胞分裂中期相染色体畸变和染色体分离异常。,结果：,裂隙，断裂，断片，微小体，染色体环等。,32/57,常染色体异常,Down syndrome,(trisomy 21):,先天愚型,或,唐氏综合征,33/57,三体综合征（,13,三体）：严重眼，脑，循环系统缺点以及腭裂。儿童生活极少超出几个月。,34/57,(,四,),姐妹染色单体交换试验,(sister-chromatid exchange,SCE),指染色体同源座位上,DNA,复制产物相互交换,其频率与,DNA,断裂和修复相关。检测,DNA,损伤灵敏指标,。,原理：,在细胞培养液中加入,5-,溴脱氧尿嘧,啶（,5-BrdU,，嘧啶类似物），在,DNA,合成期可与胸苷竞争掺入,DNA,中，经两个分裂周期后，两条染色,单体，其中一条,DNA,链双链内,T,被,5-,溴脱氧尿嘧啶核苷取代，另一,条只有一条链被取代。用染色剂处,理，使双链含,BrdU,染色单体着色,浅淡，单链含,BrdU,染色单体着色,深。当姐妹染色单体间发生同源片,段交换时，就能够依据每条染色单,体夹杂着深浅不一着色片段加以,区分。,35/57,(,五,),果蝇伴性隐性致死试验,原理,依据隐性基因在伴性遗传中,交叉遗传特征,，即雄蝇,X,染色体传给,F1,代雌蝇。又经过,F1,代传给,F2,代雄蝇。位于,X,染色体上隐性基因能在半合子雄蝇中表现出来。据此推断致死突变存在。,结果：,能检出点突变，小缺失，重排。,优点：判断突变终点客观、不需活化。,不足：与哺乳动物差异较大。,36/57,(,六,),显性致死试验,1.,原理,对雄性动物染毒，观察一个精子发育周期中各个阶段雌鼠出现受精卵在着床前死亡和胚胎早期死亡。,致突变物引发哺乳动物生殖细胞染色体发生结构和数目改变。,2.,检测整体哺乳动物,生殖细胞遗传性（染色体畸变）损伤,方法。,是评价化学毒物对,雄性动物,生殖细胞遗传毒性很好方法之一。,不足：灵敏度差，动物数量大，一定受孕率。,37/57,（七）程序外,DNA,合成试验,(,unschedule,DNA,synthesis,，,UDS),当,DNA,受损伤时，损伤修复,DNA,合成主要在,S,期以外其它细胞周期，称程序外,DNA,合成,*。,原理：,观察分离或培养细胞，加入标识,DNA,合成原料，如,3,H-,胸苷，测定,S,期以外,3,H-,胸苷掺入胞核量，判断受试物是否造成,DNA,损伤,。所以发觉,UDS,增高，即表明,DNA,发生过损伤。,38/57,39,(,八,),单细胞凝胶电泳试验,(single cell gel electrophoresis,，,SCGE),（彗星试验,(comet assay),）,一个快速检测哺乳动物细胞,DNA,损伤试验方法。,原理,：,DNA,损伤后，断裂,DNA,片段比大片段,DNA,迁移更加快，电泳后出现彗星状，即可判断,DNA,损伤。,细胞,DNA,不一样损伤程度彗星电泳图,依据,“,彗星,”,尾部占头部大小百分比将细胞损伤分为：,0-,无损伤,95%,39/57,几个遗传毒理学试验哺乳动物性细胞致突变物筛检可靠性评价,试 验 灵敏性,(%),特异性,(%),准确性,(,),Ames,试验,17/19(89%)3/10(30%)20/29(69%),骨髓细胞染色体畸,18/18(100%)2/10(20%)20/28(71%),变试验或微核试验,显性致死试验,18/18(100%)8/10(80%)26/28(93%),40/57,惯用遗传毒理学试验特点,试验,指示生物,细胞类型,染毒路径,遗传学终点,细菌回复突变,试验,原核,-,体外,基因突变,哺乳动物细胞基因突变试验,哺乳动物细胞,体细胞,体外,基因突变,染色体畸变试验,哺乳动物细胞,体细胞,体外,染色体损伤,哺乳动物：骨髓,体细胞,体内,染色体损伤,哺乳动物：睾丸,性细胞,体内,染色体损伤,微核试验,哺乳动物：骨髓,体细胞,体内,染色体损伤,/,非整倍体,显性致死试验,哺乳动物,性细胞,体内,染色体损伤,程序外,DNA,合成试验,哺乳动物：大鼠肝,体细胞,体内,DNA,损伤,姐妹染色单体交换试验,哺乳动物细胞,体细胞,体外,DNA,损伤,41/57,（九）观察方法新进展（自学）,1.,转基因小鼠致突变检测系统,2.,微核自动化检测技术,3.,荧光原位杂交技术,42/57,致突变试验应用实例,怎样设计？,分组（化合物）,选择致突变试验组合,体外，体内,观察遗传学终点,做出评价,43/57,致突变试验应用实例,44/57,45/57,46/57,致突变试验应用实例,空气污染,家庭装潢有害气体致小鼠遗传毒性试验,47/57,三、致突变试验中一些问题,（一）阴性和阳性对照设置,阴性对照,为了获取试验基础数据。,阳性对照,证实试验方法可靠；验证试验者在本试验条件下，完成技术和判定致突变物能力；证实经一段时间后，本试验重复性。,48/57,(,二,),体外试验活化系统,1,哺乳动物细胞介导,使用完整细胞，尤其是大鼠肝原代细胞，与测试细菌或细胞一起培养。,特点：,这也是一个活化系统。它有完整细胞结构和各种酶及内源性辅助因子，代谢能力优于无细胞系统如,S,9,。,不足：,但不如体内活化系统。,49/57,2,S,9,S,9,指经酶诱导剂处理后制备肝匀浆，再经,9000g,离心分离所得上清液，加上适当缓冲液和辅助因子。,特点：,它主要含有混合功效氧化酶,(MFO),，是国内常规应用于体外致突变试验代谢活化系统。,缺点：,S,9,随试验动物种属或器官不一样而有差异；,S9,含有大量亲核物质有可能影响试验敏感性。,50/57,3,纯化酶和基因工程,纯化酶：,应用纯化细胞色素,P-450,、谷胱苷肽转移酶及过氧化物水解酶，可严格控制代谢产物诱发突变条件，但技术难度大。,基因工程：,将人细胞色素,P-450,基因，插入组合细胞内，用上述细胞进行致突变试验，使细胞含有代谢活化系统。,不足：不可能完全取代整体动物代谢。,51/57,（三）致突变试验与致癌试验关系,已知致突变作用是致癌机制之一。,利用致突变试验预测致癌性时，应该考虑敏感度与特异性。经过互补复合试验加以克服。,致突变试验仅可检出遗传毒性致癌物。,52/57,（四）试验结果在毒理学安全性评价中作用,1.,试验质量控制,：盲法观察；阴性对照和阳性对照设置；资料统计学分析；试验结果重现性。,2.,阴性结果判定条件：,最高剂量应包含受试物溶解度许可或灌胃量许可最大剂量；各剂量组间差距不应过大，以防漏检。,3.,阳性结果判断：,含有剂量,-,反应关系，即剂量越高，致突变效果越大，并在一组或多组观察值与阴性对照之间有显著差异。,53/57,常见短期致突变试验：,Ames,试验,哺乳动物染色体畸变分析,微核试验,以上试验结果用来评价化学物质对人类潜在遗传毒性。假如一个物质经几个测试系统证实有致突变性，除非有令人信服证据表明对人是非致突变物，不然应考虑其对人也是致突变物。,54/57,复习题,1,突变定义？化学毒物致突变类型有哪几个？,2,突变后果有哪些？致突变与致癌、致畸关系？,3,致突变试验时为何需要一组配套试验？选择一组试验时应注意哪些事项？,4.,体外试验为何要加活化系统？惯用活化系统是什么？,5.Ames,试验、微,核试验、染色体畸变试验原理和目标是什么？,55/57,分析题,有些中药能够抗突变作用，而其它一些则含有诱导突变作用，如抗肿瘤药山慈菇能诱导小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率增加；补阳药杜仲水碱提取物,Ames,试验和微核试验均为阳性；补血熟地黄、当归水煎剂有致染色体畸变作用。中药致突变作用对主要安全评价和安全用药有什么启示？怎样系统评价中药遗传毒性？山慈菇抗肿瘤作用和致突变作用在机制上有什么联络？,56/57,课后作业,1.,为何检验致突变物需要一组配套试验？在选择一组试验注意哪些？,2.,谈谈致突变与致癌、致畸关系，说明致突变有哪些后果。,57/57,