液相色谱基础知识-(00001).ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Thrid Level,关于色谱,色谱是一种分离工具，而不是传统意义上的分析仪器,常见的分离方式：,蒸馏、离心、电泳、过滤、超滤,等等,色谱,是其中一种分离工具,色谱法简介,色谱法（Chromatography）,溯源,俄国科学加1903年发现色谱的吸附原理，开创了应用吸附原理分离植物色素的新方法并见诸于俄文的文献,1906年正式命名（见诸文献）,色谱法；Chromatography,50年代开始广泛研究和应用,主要是气相色谱及薄层色谱,高效液相色谱法的广泛应用始于70年代,色谱的发明人,俄国科学家：M.S.Tswett,正式命名“色谱”的文献,什么是液相色谱,气相色谱：流动相是气相,液相色谱：流动相是液相,什么是高效液相色谱,High Performance Liquid Chromatography,高效液相色谱法，简称：HPLC,是一种区别于经典液相色谱；基于仪器方法的高效能分离手段：,高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以及高灵敏度的检测器,广泛应用于各个领域：,医药/环保/石化/生命科学/食品及农业,在技术，理论及应用上仍处于发展阶段,液相,色谱的基本流程图,流动相,泵,色谱柱,检测器,泵,输,液,分离,检测,记录,A,E,G,B,C,D,F,进样阀,进样,HPLC的仪器配置,色谱泵,自动进样器,色谱柱及柱温箱,检测器,数据处理系统,溶剂,HPLC,的应用,在食品研究中的分析应用,食品中的天然成分,碳水化合物,类脂化合物、甘油三酸酯、胆固醇,脂肪酸和有机酸,蛋白、肽、氨基酸,食品添加剂,酸味剂、甜味剂、香精、乳化剂,抗氧化剂、防腐剂,颜料和染料（色素,维生素,污染物,霉菌（黄曲霉毒素,农药和,兽药残留,多环芳烃（PAHS,和亚硝酸,HPLC,的应用,在兽药研究中分析应用,在医药研究中分析应用,药物分析有USP、BP、CP等标准,常用药物研究中的应用：解热镇痛药、镇静药、安定药、心血管药、磺胺类消炎药等。,甾体药物研究中的应用：肾上腺皮质激素、雄性激素、雌性激素和孕激素等。,抗菌素类药物研究中的应用：青霉素、头孢菌素、庆大毒素、四环素、氯霉素、诺氟沙星等。,中草药研究中的应用：生物碱、甙类(皂甙、强心甙、黄酮甙等)、萜类,手性药物,研究中的应用：光学异构体的拆分(如解毒剂D-,青霉胺毒性小，L-异构体毒性很强),医疗药物的检测、新药研究、药物代谢、药代动力学研究。,HPLC,的应用,在生物化学和生物工程中的应用,氨基酸、多肽和蛋白质的分析研究,核碱、核苷、核苷酸和核酸的分析研究,生物胺的分析研究（儿茶酚胺类),在精细化工分析中的应用,醇、醛和酮、醚的分离分析,酸和酯的分离分析,表面活性剂的分析,聚合物的分析研究,药物、农药、染料、炸药等工业产品,在无机离子分析中应用,饮用水、酸雨、土壤中阴离子和阳离子分析,HPLC,的应用,在公安、刑警破案工作需要,毒品分析等,在环境污染分析中的应用,废气、废水、废渣中多环芳烃、多氯联苯、农药残留、酚类和胺类的检测,*,2004年获悉，世界上化合物总数达到,4700,万，其中绝大部分是有机化合物，而大约有70以上是不挥发的。对HPLC,来说，只要被分析物质在流动相溶剂（各种各样中有一定的溶解度便可分析。所以，HPLC在各行各业有着广泛的应用潜力。,高效液相色谱基本概念,色谱图：HPLC图形结果（Chromatogram）,色谱图,即色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图，其纵坐标为信号强度，横坐标为保留时间。,色谱峰,保留时间（分）,基线,峰高,峰宽,响应值,液相色谱图相关术语,色谱峰 Peak,色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号的微分曲线,峰底 Peak Base,峰的起点与终点之间连接的直线,峰高 Peak Height,峰最大值到峰底的距离,峰宽 Peak Width,在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离,半（高）峰宽 Peak Width at Half Height,通过峰高的中点作平行于峰底的直线，其与峰两侧相交两点之间的距离,液相色谱图相关术语,峰面积 Peak Area,峰与峰底之间的面积,又称响应值,标准偏差；Standard Error,0.607倍峰高处所对应峰宽的一半,拖尾峰 Tailing Peak,后沿较前沿平缓的不对称峰,前伸峰 Leading Peak,前沿较后沿平缓的不对称峰,鬼峰 Ghost Peak,并非由试样所产生的峰；亦称假峰,液相色谱图相关术语,基线 Baseline,在正常操作条件下，仅由流动相所产生的响应信号的曲线,基线飘移 Baseline Drift,基线随时间定向的缓慢变化,基线噪声；N Baseline Noise,由各种因素所引起的基线波动,谱带扩展 Band Broadening,由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象,液相色谱图相关术语,死时间，t,0,Dead time,不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的时间,保留时间，t,R,Retention time,组分从进样到出现峰最大值所需的时间,死体积，V,0,Dead volume,不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的流动相体积,保留体积，V,R,Retention volume,组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积,液相色谱应用：制备型液相色谱,分离及纯化样品是液相色谱原理的直接利用,对分离及纯化的要求,化合物的稳定性,样品的复杂性,制备量的要求,纯度的要求，及纯度的鉴定,方法的安全性,液相色谱应用：分析型液相色谱,定量分析主要基于与标准品的比较,是其最大应用领域,定性分析；不是色谱的强项,基于样品的保留时间比较,借助于和其联用的紫外、质谱或其他检测器,对定量及定性分析的要求,灵敏度、精度及准确度的要求,样品量的要求；复杂样品的分析能力,容易使用,色谱方法转换,如果没有与文献或要求相近的色谱柱,转换进样量,转换流速,液相色谱实验所需的基本参数,液相色谱实验所需的基本参数,流动相：种类及配比，等度或梯度,固定相：色谱柱类型及内径、长短,流动相输送系统参数：流速,检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等,温度控制,进样量,以上参数即构成一个具体的HPLC方法；亦称色谱条件,评价液相色谱方法的标准,问题：什么样的分离结果是好的？分离度？灵敏度？,什么是色谱的分离度,分离度的公式：,R：,分离程度的量度,影响分离度的因素：,K、,及N,分离度方程：,K,是容量因子，表达了被分离组分与柱填料之间作用的强弱,是分离因子，描述两个被分离组份分离的好坏程度，是化学因素,N 是理论塔板数，描述色谱峰谱带展宽的程度,若,N 增加 2倍 或 3倍,R会如何变化,?,分离度方程解析：柱效项,N 理论塔板数：分离效率的量度,PW=.5,PW=2,色谱柱的柱效 N,理论塔板数计算公式：,W,s,方法,W,tan,16切线法,W,h,5.54半峰高,W,3,s,9 3,s,W,4,s,16 4,s,W,5,s,25 5,s,分离度与 N 的关系,分离度方程解析：分离因子项,若,=1.1 or 1.4，R 会如何变化？,分离因子：峰分离程度的量度,V,1,V,2,V,3,V,0,时间,0.5 1 2 5,分离因子：,定义：,a,=1 时两组分分不开，,改变,a,的途径,改变固定相或改变流动相(组成),改变温度,改变样品的本身性质,通过改变流动相组成改变,，同样强度的不同溶剂,改变色谱柱,改变分离因子,的例子,若,=1,2,10 or 20,R会如何变化?,分离度方程解析：容量因子项,K,容量因子：保留能力的量度,V,0,V,1,V,2,V,3,时间,0.5 1 2 5,k,值,k,项,k对,分离度影响,0 0 0,1 1/2 .50,2 2/3 .67,3 3/4 .75,10 10/11 .91,20 20/21 .95,容量因子,k,与分离度,的关系,与 R 的关系,容量因子,k,与峰高的关系,改变,k,值的方法：,调节流动相的极性（比例）、pH、离子强度等,梯度淋洗,改变容量因子,K,的例子,谱图,、k,及,N 如何控制分离度,对称因子计算示意图,色谱峰的对称性对称因子：,a.,拖尾因子,b.,不对称因子,峰对称因子计算公式,对称因子(,f,s,)：,式中：,f,s,=0.951.05为正常峰,f,s,0.95为前延峰,f,s,1.05为拖尾峰,液相色谱原理 更进一步的探讨,离子型化合物的分离方式,多数化合物是离子型的！,使用离子交换柱：离子交换法,主要用于“强”阴、阳离子,使用反相柱,离子抑制色谱法：通过改变流动相的pH值，使样品成中性,离子对色谱法：加入“对离子”，使样品呈中性,离子抑制色谱,离子型化合物在反相色谱柱上不保留,改变流动相的pH值，抑制样品离子的电离,主要适用于弱酸性化合物的分离,降低流动相的pH值，使样品降低离子化,使用硅胶基质C,18,填料,使用条件应在填料基质的范围内,硅胶柱的pH在2-8（较保险值3-7）内,离子抑制色谱实例,而在乙腈/水并且pH=7时，多数组份保留时间很短，无法完全分离。,离子抑制色谱的使用范围,下列情况下不能使用离子抑制方法，如果：,一些酸在pH低于2时还保持离子化,一些碱在pH高于7时还保持离子化,可以有以下的选择,离子交换色谱,使用聚合物或其他耐碱性流动相的反相柱，在pH高于7时用离子抑制法,使用“离子对色谱法”,在高pH值下用离子抑制,色谱柱：D18-613(聚合物基质)，室温,流动相：乙腈/0.01M NH,4,OH,+0.01M TBA,流 速：1.0ml/min,检 测：UV-240nm,样 品：巴比妥的衍生物,巴比妥,己琐巴比妥,甲基苯巴比妥,速可巴比妥,离子对色谱法,在反相色谱流动相内加入“离子对”试剂,与样品中可电离的组份形成“对离子”,在反相色谱柱上分离离子型化合物,离子对试剂的类型,季铵盐、叔胺盐（正离子），适用于弱酸,烷基磺酸盐、高氯酸盐（负离子），适用于弱碱,烷基长度不同，形成对离子的能力不同,离子对色谱机理,抗组胺及减充血剂药物的分析,离子对色谱的应用,离子对色谱分析水溶性维生素,用离子对、还是用离子抑制方法？,