电镜技术-9.15.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,电镜生物样品制备技术,重庆医科大学生命科学院 许舸,样品制备是电镜技术中一个重要的组成部分，是电镜工作中最繁重的环节。要学习掌握好细胞超微结构知识及应用电镜技术进行研究工作，都必须首先了解电镜的标本制备技术。,透射电镜样品制备,常规,特殊,扫描电镜样品制备,常规,特殊,第一部分 常规透射电镜样品制备技术,透射电子显微镜的电子束穿透能力较弱，大多数标本无法直接在透射电镜下进行观察，必须切成厚度,10-100nm,的薄片方可使用。这种电镜观察的切片比光镜的切片要薄,100,倍左右，故,称超薄切片,（,ultrathin section,）,超薄切片制备过程示意图,一、取材,（一）取材要求：组织材料新鲜，防止各种原因引起的离体或脱离正常生活环境后的变化。,（二）取材的要点是,1,、快：,1min,2,、小,：,1mm,3,3,、利,4,、净,5,、冷,：,4,6,、准,7,、部位一致,8,、做好标记,青霉素小瓶，固定液，手术器械（剪刀、镊子等）、双面刀片、牙科蜡板（或硬纸片）、装有冰袋的保温桶、标签纸、铅笔,、,牙签,手术器械，双面刀片都需要干净，用酒精去除油脂，固定液、手术器械、双面刀片要预冷,二、固定,（,三,）理想固定剂和良好的固定标准,1,、理想固定剂应具备的条件：,穿透力强,，不产生变形,能够稳定细胞的结构和化学成分,将细胞内的成分变为不溶状态,使细胞内酶的活性和其它大分子物质的活性功能基团得以保存,能够增强图像的反差,2,、良好的固定标准：,细胞的膜系结构线条清晰，连续而不断裂，细胞基质充满密度均匀的精细颗粒，不见明显的空白区和颗粒聚集现象。细胞核结构层次清晰，无染色质不规则的聚集和异常的空白区。,二、固定,（,四,）影响固定的因素,固定剂的,pH,值、渗透压、温度、固定液的浓度、用量、固定时间等,（,五,）常用固定剂,四氧化锇,（,Osmium tetroxide,，,OsO,4,）；,又称锇酸，是电镜生物样品使用最广泛的固定剂，兼有电子染色作用，可作单固定，一般不用于电镜细胞化学实验的固定。对脂类有良好的固定作用，对糖原和核酸的保护作用差。多用于后固定。,戊二醛,（,glutaraldehyde,，,C,5,H,8,O,2,）,；,不能单独作为电镜样品固定液，对脂肪的保护作用差。没有,“,电子染色,”,的作用，通常用于前固定。,甲醛,（,formaldehyde,）,电镜多用多聚甲醛，对酶活性保存好，可与戊二醛混合或单独用于细胞化学灌流固定或作为前固定液,二、固定,（,六,）固定方法,1,、浸泡固定法：适用于大多数样品,。,先用戊二醛做前固定，锇酸作后固定，称双固定法。,2,、体内原位固定法：多用于解剖关系比较复杂或对缺氧比较敏感的组织。,3,、灌流固定,法,：适用于取材困难的柔软组织，或难以浸透、死后变化快的组织和器官。如中枢神经系统，视网膜、肾脏等,。,可以做动物的全身灌流，或是器官局部灌流。,三、漂洗,目的：,除去残留的固定液,方法：缓冲液漂洗,3,次，,10-15min,四,、,脱水,目的：使不溶于水的包埋剂能浸透入组织和细胞里,方法：,乙醇和丙酮,逐级梯度脱水,50,70,90,100,（块染：,70%,饱和醋酸铀的乙醇溶液，,4,，,1-2h,或过夜）,四,、,脱水,注意事项,（,1,）脱水既要充分，又不能在无水乙醇或丙酮中停留时间过长。,（,2,）根据材料的性质和大小，适当增加或者减少脱水时间。,（,3,）如果脱水组织需要过夜，可将之置留于,70%,脱水剂中。,五、浸透,（一）目的：用包埋剂,置换出样品中的脱水剂,（二）方法：,1,、半浸透：,100%,脱水剂和包埋剂,1:1,混合,2,、纯浸透：纯包埋剂,六、包埋、聚合,（一）包埋的目的,：,让包埋剂完全浸透到组织内部，并在一定条件下聚合成包埋块，作为细胞结构的支架，有利于制备出超薄切片。,（二）包埋剂,1,、,理想的包埋剂应具备的条件,（,1,）,聚合前粘度适中，能较快渗入组织；,（,2,）,聚合均匀充分，聚合前后体积变化小，组织无变形，微细结构保存良好；,（,3,）,聚合后有良好的切割性，软硬适度易于调整；,（,4,）,能经受电子束轰击，高温下不易升华和变形；,（,5,）,高倍下放大不显示包埋剂本身的结构；,（,6,）,对人体无害，便于操作。,六、包埋、聚合,2,、常用包埋剂,环氧树脂类：,（,1,）环氧树脂,618,：粘度大，对温度和湿度要求不十分严格,（,2,）,Epon812,：,粘度低，对湿度要求严格,加速剂：,DMP-30（2，4，6,三（二甲基氨基甲基苯酚）,固化剂：,DDSA（,十二烷基琥珀酸酐）,MNA（,六甲酸酐）,增塑剂,：,DBP,（苯二甲酸二丁酯）,六、包埋、聚合,（三）包埋方法,1、常规包埋,2、定向包埋,六、包埋、聚合,（四）,聚合,37,（,16h,），,45,（,12h,），,60,（,14h,）,七、超薄切片术,超薄切片术是应用超薄切片机制备出供透射电镜观察的超薄切片的专门技术,，它是整个制样程序的中心环节。,超薄切片的好坏与切片机的性能、切片刀的质量、包埋块的切割性能以及操作者的技术经验等因素密切相关。,进行超薄切片前，必须做好一切准备工作，如选择和清洗载网、制备支持膜、制备玻璃刀、修整包埋块等，开始切片时必须心境平稳，精力集中，避免任何干扰（如随意离位、各种震动、人员往来、尘粒污染等）。,七、超薄切片术,（一）准备工作,1,、载网和支持膜,（,1,）载网,1,）作用：,承载样品,以便后续染色和观察,2,）种类：,材质：,铜网,、,不锈钢网、金网、镍网、尼龙网、碳网,等,形状：直径,2-3mm,，厚度,20-50m,网孔数目：,200-300,目,网孔形状：,圆形、方形、单孔形、狭孔形等,3,）清洗,七、超薄切片术,（,2,）支持膜,聚乙烯醇缩甲醛（,Formvar,）膜和火棉胶膜,七、超薄切片术,2,、制刀,（,1,）种类,玻璃刀,、,钻石刀,七、超薄切片术,（,2,）玻璃刀制作,七、超薄切片术,Potential Knife Edge,锋利的刀口,Tip:For cryo-ultramicrotomy knives,this shelf should be 0.2mm or less in width(for maximum sharpness of the knives).For room temperature plastic sectioning,the shelf may be 0.5 1.0mm wide(for a more robust knife edge).,七、超薄切片术,七、超薄切片术,（二）修块,七、超薄切片术,（,三,）半薄切片,、,染色,及定位,切片厚度：,0.5-2,m,染色：,甲苯胺蓝,七、超薄切片术,（四）超薄切片,装块、装刀、对刀、加水、切片、捞片,七、超薄切片术,七、超薄切片术,七、超薄切片术,切片厚度的选择,灰色,400-500,埃,银色,500-700,埃,反差和分辨率均适中,金色,700-900,埃,紫色,900,埃以上,七、超薄切片术,（五）染色,利用重金属离子对不同细胞结构的结合能力不同，使各细胞结构对电子产生不同程度的散射，以增强明暗之比（反差）而显示出各种超微结构，故电镜标本的染色称为“电子染色”。,1,、,电子密度,七、超薄切片术,2,、,常用染色剂,（,1,）醋酸铀（,uranyl acetate,）,又称醋酸双氧铀,块染,1-2h,或过夜,片染,30min,（,2,）枸橼酸铅（,lead citrate,）,片染，易被空气中的,CO,2,污染,第二部分 透射电镜特殊样品制备,内容,:,负染色技术,电子显微镜细胞化学技术,电镜酶细胞化学技术,电镜免疫细胞化学技术,真空喷镀技术,冷冻蚀刻技术,特殊样品制备,一、负染色技术,利用高密度无结构的重金属物质把生物标本包绕起来。这种反差是负像（与正染色的超薄切片相比较）。最常用的染色剂是磷钨酸钠（,phosphotungstic acid,，,PTA,），此法常用于病毒、蛋白分子或细胞亚单位的分子结构研究，制样简单，可作快速诊断。,二、电镜细胞化学技术,又称超微结构细胞化学,，,它借助细胞内的化学反应，研究细胞内各种成分在超微结构水平上的分布情况，以及这些成分在细胞活动过程中的动态变化，以阐明细胞的,结构和,功能,的关系,。广义的电镜细胞化学技术包括电镜酶细胞化学技术、电镜免疫细胞化学技术、特异酶消化印证技术、电镜放射自显影、超微示踪技术、,X,射线微区分析法等。,二、电镜细胞化学技术,（一）电镜酶细胞化学技术（,electron microscopic cytochemistry of enzyme or ultracytochemistry of enzyme,）,基本原理和内容,利用酶催化反应特点，从亚微结构上研究酶的分布和活性。按其催化反应的性质可分为水解酶、氧化还原酶、转移酶、裂解酶、合成酶和异构酶六大类，应用较多的有水解酶和氧化还原酶。现以水解酶为例，介绍此技术的主要过程和基本原理。,初级反应：底物被磷酸水解酶作用后分解产生磷酸。,底物 磷酸水解酶,H,3,PO,4,最终反应：磷酸与金属捕捉剂结合形成反应产物。,H,3,PO,4,捕捉剂（如,Pb,2+,）,Pb,3,(PO,4,),2,最终反应产物为电子致密的沉淀物，电镜下易于观察并显示出酶的定位。近年来常用铈（,Ce,3+,）作为捕捉剂。,二、电镜细胞化学技术,二、电镜细胞化学技术,应用,主要用于：（,1,）酶在超微结构上的定位，（,2,）标记和鉴定某些细胞和细胞器，（,3,）通过显示过氧化物酶，定位示踪,HRP,（,4,）利用免疫酶技术，电镜下显示特异性标记物的定位。,目前应用电镜技术常显示的标志酶有：,各种细胞器的标志酶,细胞器,标志酶,内质网,核苷二磷酸酶，葡萄糖,-6-,磷酸酶,高尔基体,焦磷酸硫胺素酶（,Trans,膜囊）、烟酸胺腺嘌呤二核苷磷酸酶（中间膜囊）,溶酶体,酸性磷酸酶,微体,过氧化氢酶,线粒体,细胞色素氧化酶、琥珀酸脱氨酶,细胞膜,核糖核苷磷酸酶（如,ATP,酶）、碱性磷酸酶,二、电镜细胞化学技术,Figure 10 G-6-Pase reaction products were rich in Leydig cell of the control group rats.20 000,Figure 11 G-6-Pase reaction products decreased,markedly after 3 d of cadium treatment.20 000,Figure 12 Showing intense G-6-Pase reaction products of Leydig cell after 3 d of cadium add zinc treatment.20 000,二、电镜细胞化学技术,RER,G-6-Pase,Mito.,SDH,二、电镜细胞化学技术,（二）电镜免疫细胞化学技术,简称免疫电镜（,immunoelectron microscopy,）是将光镜下的免疫组织化学、免疫细胞化学与各种电镜技术有机地结合起来，在细胞超微结构水平上研究抗原抗体反应，进行抗原的超微结构水平定性、鉴别和定位的一种技术。,1,、常用免疫电镜方法的原理,PAP,法,（,peroxidase-antiperoxidase,）,又称可溶性酶,-,抗酶法。特点为参加反应的抗体都不被酶直接标记。步骤：第一抗体（,Ab,1,）与组织中特异性抗原（,Ag,）相结合形成抗原抗体（,Ag,Ab,1,）复合物；用第二抗体（,Ab,2,）的一个,F,ab,段与第一抗体结合，另一个,F,ab,段游离，形成抗原,-,第一抗体,-,第二抗体（,Ag-Ab,1,-Ab,2,）复合物；用过氧化物酶,-,抗过氧化物酶复合物（,PAP,，与,Ab,1,同种动物的血清）与第二抗体的游离,F,ab,段结合，形成,Ag-Ab,1,-Ab,2,PAP,复合物；用过氧化氢,和二氨基联苯胺（,DAB,）使,PAP,的过氧化物酶形成不溶的、暗棕色的嗜锇化合物,。优点：保存抗体活性好；,PAP,复合物稳定；敏感性高，比间接免疫荧光抗体法敏感性高,100,1000,倍；由于敏感性高,节约了抗体用量,也减少了非特异性背景染色。缺点：反应产物颗粒较大，遮盖背景；,DAB,有致癌作用，操作中需格外小心；内源性氧化酶对此法有干扰。,ABC,法,基本原理：,抗生物素,-,生物素,-,过氧化物酶复合物技术（,Avidin-Biotin-Peroxidase Complex Technique,）简称,ABC,技术，是目前常用的免疫细胞化学技术之一。,1979,年,Guessdon,首先把生物素,-,卵白素技术用于免疫组织化学，先后设计出桥式卵白素,-,生物素（,BAB,）技术和标记式卵白素一生物素（,LAB,）技术，,1981,年,Hsu,和许世明在,BAB,法和,LAB,法基础上改良而建立了,ABC,法，其基本原理与,PAP,法相似，特点是利用抗生物素分别连接生物素标记的第二抗体和生物素标记的过氧化物酶，形成抗原,-,第一抗体,-,生物素标记的第二抗体,-,抗生物素过氧化物酶复合体（,Ag,Ab,1,Ab,2,ABC,）。抗生物素又称卵白素（,Avidin,），它有四个活动结合点，并与生物素有特别高的亲和力，一旦和生物素结合就极为稳定。当生物素和第二抗体共价偶联后，就使第二抗体获得与抗生物素相结合的能力。,胶体金标记技术,优点：,（,l,）胶体金可标记各种不同的生物大分子,(,如免疫球蛋白、葡萄球菌,A,蛋白、植物凝集素、刀豆球蛋白,A,等,),，并使其保持原有的生物学活性。（,2,）胶体金标记技术可适用于光镜、透射及扫描电镜、,X,射线能谱分析、荧光显微镜等。（,3,）胶体金非特异性吸附作用小、特异性强。（,4,）金颗粒电子密度大，电镜下检出率远比,DAB,反应产物高，敏感性比,PAP,法高,20,200,倍、比,ABC,法亦高数倍。（,5,）胶体金标记物是颗粒状物，电镜下易于计数，可直接定量检测抗原。（,6,）胶体金标记不受内源性物质影响。（,7,）胶体金颗粒直径可根据需要控制，将不同直径的肢体金分别标记不同抗体或抗原，可在同一张切片上同时区分两种或两种以上的抗原或抗体，特别适合于电镜水平的双标记或多标记。（,8,）胶体金标记和,IGSS,特别有利于回顾性研究,如过去病理外检的石蜡切片和电镜包埋块,需要时可进行胶体金标记研究。胶体金的颗粒较大,穿透性弱,是它的主要缺点。,二、电镜细胞化学技术,2,、技术概述,固定液选择,包埋前染色,：,在未经包埋的预切薄片上先进行免疫染色，将免疫反应阳性部位取出，修成小块，然后再按常规电镜方法处理，经锇酸固定、脱水、包埋、超薄切片。,包埋后染色,：,组织标本经固定及树脂包埋，制成超薄切片后，再进行免疫组织化学染色。由于是以贴在,载,网上的超薄切片进行免疫染色，故又称为载网染色。,三、真空喷镀和离子溅射技术,（一）真空喷镀技术,真空状态下，金属加热到一定温度后，将以细颗粒形式向四周发射，在样品表面形成一薄膜，当样品与金属源呈一定角度（,11,-45,）放置时，面向金属源的部分会有较多的金属物质沉积，背向金属源的部分则没有金属物质沉积，样品的反差得以加强。又称金属投影法（,metal shadowing,）。可用于观察病毒、噬菌体、大分子的形状。常用的金属源有金、铂、钯、碳等,。,三、真空喷镀和离子溅射技术,（二）离子溅射技术,与真空喷镀的区别在于：真空度不同，重金属离子运动的方向不同，镀膜效果较前者好，金属用量可少,10,倍，镀膜更为均匀。,四、冷冻蚀刻技术（,freeze etching,）,又称冷冻复型，是冷冻断裂与复型相结合的技术，该技术主要用于生物膜内部及细胞内部三维结构的研究，如核孔复合体、细胞连接等。,快速冷冻固定标本,-,断裂,-,蚀刻,-,复型,-,复型膜分离,-,捞网,冷冻割断技术,（,SEM,观察脏器或细胞内部结构）,五、几种特殊样品制备,（自学）,1,、甲醛固定石蜡包埋样品,加温（,60,），切取,1mm3,大小组织块,脱腊：氯仿或二甲苯,还原水分：,100%95%70%35%,乙醇,0.1mol/L,磷酸盐缓冲液浸泡,常规电镜标本制备,2,、培养细胞,3,、骨组织,五、几种特殊样品制备,4,、血细胞样品,1,）白细胞：,2,）血小板：,第三部分 扫描电镜样品制备技术,扫描电镜是利用收集二次电子信息成像，观察各种生物样品的表面结构。因此，扫描电镜生物样品制备便是围绕如何使样品要观察的表面完好无损的暴露，以及获得优质的二次电子图像而展开。,一、,SEM,生物样品制备的基本要求,（一）每一处理步骤及操作过程中，都应注意防止对样品的污染和损伤，使被观察的样品尽可能地保持原有的外貌及微细结构。,(,二）去除样品内的水份，以利于维持,SEM,的真空度和防止对镜筒的污染。但在脱水和干燥处理时，要尽量减少和避免样品体积变小，表面收缩变形等人工损伤。,（三）降低样品表面的电阻率，增加样品的导电性能，以提高二次电子发射率，建立适当的反差和减少样品的充放电效应。,（四）无论观察组织细胞的表面或内部微细构造，都应注意确认和保护样品的观察面。,二、,SEM,生物样品制备的基本操作程序,（一）取材,主要要求：,取材前应作好药品、器材准备；,取材部位要准确，取样大小要适当，以观察组织细胞表面结构为主的样品直径最大不宜超过,5mm,，高度,35mm,；以观察组织细胞内部结构为主的样品，其直径应小于,2mm,，高度可在,3mm,左右；,为了使被观察的样品更接近于活体状态，材料应尽量新鲜。,（二）样品的清洗,SEM,观察，对样品表面的清洁要求十分严格。在样品制备过程中，应始终注意清除覆盖在样品表面的粘液、分泌物、组织液、血液、细胞碎片及药物反应沉淀物等所造成的污染。否则，不仅会掩盖样品表面的微细结构，甚至会得出错误的结果和判断。,1,、清洗液的选择：,一般组织表面：,NS,PBS,；,游离细胞及悬浮小样品：,PBS,或等张液；,表面覆盖大量粘液的样品：蛋白水解酶；,其他：,内耳壶腹嵴表面的胶纸状膜,（,5-10%,盐酸,）,（二）样品的清洗,2,、清洗方法,振荡、冲洗、离心、超声,3,、清洗时的注意事项,在选择清洗液时，要使其离子浓度、,PH,值、渗透压及清洗液的温度，尽量符合组织细胞处于活体状态时的生理条件，以免引起样品的收缩膨胀变形及其他人工损伤性变化。,往容器内添加和更换清洗液时，应沿瓶壁缓缓滴加；移动样品时，要采用牙签贴附法，以避免强力冲击和夹持样品可能出现的损伤。需用喷射、超声或作用较强的溶剂清洗样品时，要严格控制强度、时间，密切观察样品的变化。,在清洗特别是在换液过程中，应把时间安排紧凑，要始终使样品保持湿润，严防发生空气干燥，以免造成标本的皱缩、塌陷变形。,（三）样品的固定,1,、常用的固定剂,2,、固定的温度及时间,3,、固定时的注意事项：,固定时放置样品的玻璃容器必须经过净化和干燥处理，以防止污染或产生其它化学反应。,固定剂的液体量要充分，每一容器内所固定的样品数量要少（最多不能超过,3,4,块），固定期间要间断轻晃容器，以保证样品得到充分固定。,固定液配制后需存放在,4,冰箱内，但最好不要久存，使用前应测其,pH,值。使其符合其固定要求（,pH7.2-7.3,）。若固定液偏酸，则会降低固定效果并可致细胞出现损伤性变化。,（四）脱水,1,、脱水剂：乙醇、丙酮,2,、方法：逐级梯度脱水,30%,50,70,80%,90,100,（五）样品的干燥处理,尽管,SEM,生物样品经过脱水以后，所含大部分水分已被脱水剂取代。但在样品内都含有脱水溶剂并残留少量水分，仍不符合,SEM,高真空条件的要求。特别是样品表面溶剂及残留水分所形成的表面张力，在高真空状态下会导致表面结构的严重破坏。因此，经过脱水的样品，仍需进一步干燥处理，此为,SEM,样品制备的成败关键。,1,、空气干燥法（自然干燥法）,2,、真空干燥及冷冻干燥法,（五）样品的干燥处理,3,、临界点干燥法：,任何物质存在的固态、液态和气态三种形式可以相互转化。当温度、压力达到一定的数值时，气体的密度可增大到与液态一样。此时气相与液相的界面消失，液体的表面张力亦会随之消失。上述情况称为临界状态。,临界点干燥器,玫瑰花瓣表面的,SEM,照片,(850X),，,CPD,干燥,玫瑰花瓣表面的,SEM,照片,(850X),，风干凝固,（五）样品的干燥处理,4,、叔丁醇干燥法,在冷冻干燥法的基础上建立的新方法。,脱水处理后的标本分别置于,30%,、,50%,、,70%,和,100%,叔丁醇,15min,，然后将标本容器置于液氮及其它骤冷剂中冷冻；,将样品移入真空镀膜仪内，样品中已结冰的叔丁醇及其溶剂在低真空下升华为气体，样品随之干燥。,叔丁醇减少了单纯冷冻干燥形成的冰晶对样品的损害。,（六）样品的粘胶与安置,（七）样品的导电处理,（镀膜）,在样品以及样品托表面同时喷镀一层金属膜,目的：,增强生物样品的导电性能,，,提高二次电子发射率,，增强样品机械强度,要求：镀膜必须薄而均匀，本身无结构，能够再现样品表面的固有形态，化学性质稳定，不与样品发生化学反应,方法：金属镀膜法,组织导电技术（非镀膜法）,（七）样品的导电处理,（镀膜）,1,、金属镀膜法,真空喷镀法,方法：,在高真空中使金属加热蒸发，,在样品表面,喷镀,一层金属膜,缺点：金属损耗大，容易产生热,辐射,损伤，容易形成“死角”,金属,：,金、铂,、,金,-,铂合金、铂,-,钯合金,（七）样品的导电处理,（镀膜）,离子溅射法,（七）样品的导电处理,（镀膜）,2,、组织导电技术（非镀膜法）,（,1,）概念：利用,重金属盐类化合物可与生物组织内蛋白质、脂类和淀粉起化学结合作用，以达到样品表面离子化、增强样品导电率和减少充放电效应的目的。,该技术,还可提高固定效果，防止组织变,形,损伤及增强样品对电子束轰击的耐受力。,（七）样品的导电处理,（镀膜）,（,2,）,基本操作程序,（,3,）常用的组织导电法,单宁酸,-,锇酸法：将经过常规取材（或灌流取材），固定的样品，放进,2-4%,单宁酸或该液与,1-6%,戊二醛混合液中（时间：表面扫描时,30,分钟，观察内部结构时,8,小时以上），重复,2,次，每次处理后均需充分清洗，然后将样品放入,2-4%,锇酸中,30,分钟至数小时，经常规脱水及干燥处理，送,SEM,观察。,三、几种适应特殊要求的制样技术（自学）,（一）游离细胞样品制备法：,1,、样品的清洗与固定：由于游离细胞易受渗透压的影响，以选用低浓度的固定液和等张的清洗液为宜。一般在小型烧瓶内加入,1%,戊二醛,20ml,磷酸缓冲液配制），再滴入,2-3,滴细胞混悬液，用力摇动数分钟，即可除去血细胞和精子表面附着的血浆或精液，而达到清洗和固定双重目的。亦有人主张，可先用等张溶液对样品进行清洗，而后再作固定。,三、几种适应特殊要求的制样技术,2,、样品的脱水与干燥,3,、,样品表面金属镀膜和,SEM,观察，与一般方法相同,三、几种适应特殊要求的制样技术,（二）组织细胞内部结构观察法,组织细胞内部结构简易剖出法：,（,1,）刀片切断法：将双面刀片用丙酮擦拭干净，去除油脂，然后用双面刀片切割已经固定，脱水和干燥后的组织。最后，贴好样品，进行喷镀和,SEM,观察。本法适用于肺等多孔组织。,（,2,）镊子掰开法：像肝脏等实质性器官，可以选用此法，即将经过固定，脱水和干燥后的组织，在组织割断之处，用双面刀片和刀刃先切一道缝，再用镊子把裂缝两侧的组织掰开，便可观察所出现的两个观察面。,（,3,）双面胶带法：把双面胶带粘在样品台上，将经过固定，脱水和干燥的组织压在上面粘好，然后向上一拉，拉断的组织的一部分粘在胶带上，经过金属镀膜以后，就可以用,SEM,观察其断面结构，此法可用于肌肉纤维等组织观察。,第四部分,电镜观察要领及人工损伤的识别,（一）电镜观察要领,1,、正确判断和应用放大倍率：,原则：从低倍到高倍，以利于判断细胞组织种类，医学生物学范围内多用,1-2,万倍，多数问题在,5,万倍以下就能解决。,2,、具有全局的观点：,注意宏观提示，光镜和其他检查结果，防止片面性；电镜观察时注意连续追踪，仔细全面，一定要有严格的正常对照；提倡,2,人以上同时观察。,3,、及时作好拍片记录和观察小结；,4,、重视基础理论指导：,良好的认识水平来自于坚实的专业理论知识和丰富的实践经验。电镜观察如果缺少必要的认识基础，其结果是视而不见，见而不知其义。因此必须做好文献准备，科研设计，有一定的超微结构知识，才能解释图像，提高观察分析水平。,第四部分,电镜观察要领及人工损伤的识别,（二）人工损伤（,artifact,）的识别,1,、人工假像（损伤）,可接受,重复出现，如电子染色，喷镀，是技术上所追求的,不可接受,不恒定，不重复，技术上的失误造成，应避免。,2,、常见的人工假像：,固定不佳，刀痕，震颤，铅污染，过染,等。,不可接受人工损伤可在制样的全过程中出现，尤以固定损伤为重，此种损伤改变与病理学上的改变不易区别。由于在标本制备和切片过程中所产生的问题常常不是肉眼所能察觉，只有在电镜观察时才会发现，故有人称生物样品处理过程为,“,时间、精力和心血,”,的堆积。只有自始至终贯彻“精细,”,二字，制备出高质量的样品，才能获得良好的正确的观察结果。,对有诊断价值的病理组织，尽管已知人工损伤，但可考虑在处理后进行电镜观察，以明确诊断。,