基因工程绪论.ppt

Haga clic para modificar el estilo de ttulo del patrn,Haga clic para modificar el estilo de texto del patrn,Segundo nivel,Tercer nivel,Cuarto nivel,Quinto nivel,*,*,Haga clic para modificar el estilo de ttulo del patrn,Haga clic para modificar el estilo de texto del patrn,Segundo nivel,Tercer nivel,Cuarto nivel,Quinto nivel,*,*,Haga clic para modificar el estilo de ttulo del patrn,Haga clic para modificar el estilo de texto del patrn,Segundo nivel,Tercer nivel,Cuarto nivel,Quinto nivel,*,*,：,13916119212 021-67792648,：,liny,生物所,3121,蛋白质剪接课题组,Protein Splicing Engineering Laboratory,教学形式与考核办法,课程类型：专业选修课,(,建议必修,),理论课：,32,学时,学分：,2,学分,教材：,基因工程,何水林等编,考核：平时,(20%)+,期末考试,(80%),闭卷考试,平时成绩评定,考勤（旷课、迟到、早退等）,作业（按时、不抄袭）,平时表现（课堂回答问题等）,教师主讲、主动参与,自学、讨论,BASIC STEPS IN GENETIC ENGINEERING,Isolate the gene,Insert it in a host using a vector,Produce as many copies of the host as possible,Separate and purify the product of the gene,第一章 绪论,第二章,DNA,重组,第三章,基因克隆载体,第四章,目的基因的制备,第五章,目的基因导入受体细胞,第六章,外源基因的表达,第七章,基因工程的应用,基因工程,第一章,绪论,一、基因工程的,定义,二、基因工程的,理论依据,三、基因工程的,诞生与发展,四、基因工程的,基本操作步骤,五、基因工程的,应用,研究,六、基因工程的,安全性,问题,一、基因工程的定义,按照预先设计好的蓝图，利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对一种生物（供体）的遗传物质（,DNA,）直接进行,体外重组,操作与改造，并转移到另外一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。,指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的,DNA,体外操作程序，也称为,分子克隆技术,。,供体、受体、载体,是,DNA,重组技术的三大基本元件。,DNA,的体外重组,=DNA,重组技术,克隆（,Clone,）,当作名词使用时，是指从一个,共同祖先,无性繁殖下来的一群遗传上相同的,DNA,分子、细胞或个体所组成的特殊的生命,群体,。,当作动词使用时，则是指从同一祖先产生这类同一的,DNA,分子群体、细胞群体或个体群体的,过程,。,DNA,重组技术实际上也可称为狭义上的基因工程。,广义上的基因工程,：也可指,DNA,重组技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术。,上游,技术：外源基因重组、克隆和表达的设计与构建（,DNA,重组技术）。,下游,技术：含有外源基因的生物细胞（基因工程菌或细胞）的大规模培养以及外源基因的表达、分离、纯化过程。,二、基因工程的理论依据,（,1,）,不同基因具有相同的物质基础,（,2,）基因是可以切割的,（,3,）基因是可以转移的,（,4,）多肽与基因之间存在对应关系,（,5,）,遗传密码是通用的,（,6,）基因通过复制可以把遗传信息传,递给下一代,基因工程诞生的理论基础,1,、,DNA,是遗传物质,（,1,）肺炎双球菌转化实验,1944,年，,Avery,确定了基因的分子载体是,DNA,，而不是蛋白质。,（,2,）噬菌体转染实验,1952,年，,Alfred Hershy,和,Marsha Chase,进一步证明遗传物质是,DNA,。,基因工程的产生需要有理论和技术上的支持。,Griffith,（,1928,）无论是加热灭活的,S-,型或活的,R-,型细菌都不能杀死小鼠，但将两者同时注射入小鼠体内则能够引发小鼠的败血症，使之死亡，就像单独注射活的,S-,型细菌一样，同时从死鼠体内发现了活的,S,型细菌。,说明：高温杀死的,S,型细菌使某些活的,R,型细菌转化成,S,型细菌。,S,型细菌有一种物质或转化因素进入了,R,型细菌，引起了,R,型细菌发生了稳定的遗传变异。,Avery,等（,1944,）从,S,型细菌中分别抽提出,DNA,、蛋白质和莢膜多糖物质，并把每一种成分同活的,R,型细菌混和，悬浮在合成培养液中。,结果发现只有,DNA,组分能够把,R,型细菌转变成,S,型细菌；,DNA,纯度越高，转化效率也越高。,说明：,DNA,赋予生物体特定遗传特性。,S,型细菌的转化因子是什么物质？,是多糖？蛋白质？还是,DNA,？,肺炎双球菌转化实验（,1944,）,Hershey&Chase,等（,1952,）噬菌体感染实验：,32,P,和,35,S,分别标记,T2,噬菌体的核酸和蛋白质。,噬菌体转染实验（,1952,）,1953,年,James D.Watson,和,Francis H.C.Crick,揭示了,DNA,分子的双螺旋结构和半保留复制机制。,2.DNA,双螺旋结构,3.,中心法则和遗传密码,1957,年,Crick,又提出了遗传信息传递的,“,中心法则,”,。,1964,年,Marshall Nirenberg,和,Gobind Khorana,等终于破译了,64,个遗传密码。,基因工程诞生的技术突破,1,、限制性内切酶,1970,年,H.O.Smith,等分离出第一种限制性核酸内切酶。,Werner Arber,理论预见限制酶,Daniel Nathans,用限制酶切得,SV40 DNA,片断,Hamilton O.Smith,得到第一个限制酶,1978,年,Nobel,生理或医学奖,2,、,DNA,连接酶,1967,年,5,个实验室几乎同时发现了,DNA,连接酶。,3,、载体,1972,年前后,使用小分子量的细菌质粒和,噬菌体作载体。,4,、感受态体系,1970,年,M.Mandel,和,A.Higa,发现经过氯化钙处理的大肠杆菌容易吸收噬菌体,DNA,。,1972,年,S.Cohen,发现这种处理过的细菌同样能吸收质粒,DNA,。,5,、逆转录酶的发现,1970,年美国科学家特明（,H.M.Temin,）和巴尔的摩（,D.Baltimore,）分别于动物致癌,RNA,病毒中发现逆转录酶，他们并因此获得,1975,年度诺贝尔生理学,/,医学奖。,David Baltimore,Howard Martin Temin,三、基因工程的诞生与发展,Berg,的开创性实验,1980,年,Nobel,化学奖,1972,年斯坦福大学的,Paul Berg,小组完成了首次体外重组实验：,将,SV40,的,DNA,片段与,噬菌体的,DNA,片段连接起来。,Boyer,Cohen,实验,1973,年斯坦福大学的,S.Cohen,小组将含有卡那霉素抗性基因的大肠杆菌,R6-5,质粒与含有四环素抗性基因的另一种大肠杆菌质粒,pSC101,连接成重组质粒，具有双重抗药性。,后来又把非洲爪蟾核糖体基因片段同,pSC101,质粒重组，转化大肠杆菌，并在菌体内成功转录出相应的,mRNA,。这是第一次成功的基因克隆实验。,Boyer,Cohen,实验,1986 Nobel,生理或医学奖,Herb Boyer,后来还参与组建世界上第一家基因工程公司,Genetech,。,基因工程发展简史,基因工程准备阶段,理论和技术的成熟,基因工程的问世,1973,年，,Cohen,等获得了具有新的抗性标记的重组菌落，标志着基因工程的诞生。,迅速发展阶段,转基因小鼠（,1980,）、转基因烟草（,1983,）、基因工程药物、基因治疗（,1990,）、人类基因组计划（,1990,）,基因工程的特征,跨物种性,外源基因到另一种不同的生物细胞内进行繁殖。,无性扩增,外源,DNA,在寄主细胞内可大量扩增和高水平表达。,四、基因工程的基本操作步骤,（一）目的基因的获取,从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或,PCR,扩增等步骤，分离出带有目的基因的,DNA,片段。,（二）重组体的制备,将目的基因的,DNA,片段插入到能自我复制并带有选择性标记（如：抗菌素抗性标记）的载体分子上。,（三）重组体的转化,将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。,（四）克隆鉴定,筛选转化成功的细胞克隆（含目的基因）。,（五）目的基因表达,使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。,基本步骤,分,切,连,转,筛,扩（表）,五、基因工程的应用,1,、在农业生产中的应用,2,、在工业生产中的应用,3,、在医药领域的应用,4,、在环境保护中的应用,1,、在农业生产中的应用,抗虫,抗病毒,主要采用的病毒的外壳蛋白,(CP),基因导入植物的方法,使番茄、黄瓜、南瓜、甜椒等植物具有抗病性,品质改良,改进作物品质主要是质量上的改变,其次是作物抗性的改变,即抗旱、抗盐、抗热,提高光合作用效率和固氮效率等等,生物固氮,使非固氮植物转变为固氮植物或能与根瘤菌共生固氮,杂草控制,转基因抗虫棉和普通棉对照,转基因耐贮藏番茄（左）和普通番茄（右）,苏云金芽孢杆菌,(,B acillus thu ring iensis,Bt),杀虫晶体蛋白基因,2,、在工业生产中的应用,纤维素的开发利用,克隆各种参与纤维素降解的酶的基因，导入酿酒酵母，就可能利用廉价的纤维素来生产葡萄糖，发酵成酒。,酿酒工业,用外源基因改造酿酒酵母，产生优质的啤酒。或用酿酒酵母生产蛋白质等。,3,、在医药领域的应用,基因工程药物,目前，已经投放市场以及正在研制开发的基因工程药物几乎触及到医药的各个领域，包括各种抗病毒剂、抗癌因子、新型抗生素、重组疫苗、免疫辅助剂、生长因子以及诊断试剂等。,基因诊断和基因治疗,4,、基因工程在环境保护中的应用,检测水污染,用重组细菌或转基因鱼等检测水污染,生物降解,用带有重组质粒的“超级菌”分解油（烷烃类）、有机农药污染。,1.,公众的担忧,六、重组,DNA,研究的安全准则,1973,年美国的公众第一次公开表示担心应用重组,DNA,技术可能会培养出具有潜在危险性的新型微生物，从而给人类带来难以预料的后果。,1974,年美国国立卫生研究院（,NIH,）考虑到重组,DNA,的潜在危险，提请,Paul Berg,博士组成一个重组,DNA,咨询委员会。,这个由,11,名分子生物学和重组,DNA,权威学者组成的委员会在同年,7,月发表公开信（,science,158,303),，要求在没有弄清楚重组,DNA,所涉及的危险性范围和程度，以及在采取必要的防护措施之前，暂停两类试验（,带抗生素抗性和肿瘤病毒及动物病毒,）。,2.,专家的态度,3.,制定安全规则,1976,年,6,月,23,日，,NIH,正式公布了,“,重组,DNA,研究的安全准则,”,。,规定了,安全防护（物理防护和生物防护）标准,以及,禁止,若干类型的实验。,1979,年、,1981,年、,1989,年,NIH,又做了多次修改，放宽了许多限制。,分,4,级：,P1P4,级。,（,1,）实验室的物理安全,4.,基因工程的安全措施,一般装备良好的普通微生物实验室。,P1,级实验室,P2,级实验室,在,P1,级实验室的基础上还装备有,负压,的安全操作柜。,全负压,的实验室，同时装备安全操作柜。,P4,级实验室,专用的实验大楼,，周围与其它建筑物应有隔离带。,具有最高安全防护措施。,P3,级实验室,在自然环境中,无法,存活。,（,2,）实验室的生物安全,分,3,级（大肠杆菌）：,EK1EK3,级。,EK1,级的大肠杆菌,在自然环境中,一般,都要死亡。,EK2-3,级大肠杆菌,（,3,）,载体的安全,应该是失去了,自我迁移,的能力。,不会自动从“安全”的菌株转移到“不安全”的菌株中。如,pMB9,，,pBR322,等。,思考题,什么是基因工程？,2 DNA,重组的主要步骤是什么？,主要参考书：,Principle of Gene Manipulation,（影印版）,Sixth edition,Microbiology,，,Molecular biology,Internet,，,NCBI,（,www.ncbi.nlm.nih.gov,)pubmed,，,blast,Paper,，,Seminar,，,Journal Club,O(,网易公开课,),Trans,la,tion,Protein splicing,Mature protein,mRNA,Transcription,5,3,DNA,Intein Mediated,Protein Splicing,Intein,Protein 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