多重耐药鲍曼不动杆菌外排泵与外膜蛋白表达水平分析.pdf
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1、实用医学杂志 2023年第39卷第16期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.16多重耐药鲍曼不动杆菌外排泵与外膜蛋白表达水平分析黄育波 周宇麒 郑文争 朱家馨 杨海玲 吴文斌 张天托中山大学附属第三医院呼吸与危重症医学科(广州 510630)【摘要】目的分析鲍曼不动杆菌对常用抗生素的敏感性,检测外排泵基因和外膜蛋白基因的表达水平,探讨上述基因表达与抗生素耐药之间的关系。方法选择下呼吸道标本分离的鲍曼不动杆菌共213株,对其进行菌种鉴定、药敏试验;根据药敏试验将其分为不敏感组(NS组)与敏感组(S组),应用荧光定量PCR检测外排泵基
2、因(adeB、adeJ、adeG、craA、abeM、amvA)、外膜蛋白基因(omp25、omp33-36、carO)的表达水平,比较上述基因在NS组与S组表达水平的差异。结果鲍曼不动杆菌对阿米卡星、亚胺培南不敏感率分别为89.2%、81.2%,对哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、庆大霉素等药物的不敏感率均超过92%。adeB基因相对表达量升高(RE 1)在各抗生素(AMK、IPM、CFP、FEP、TZP、CAZ、SXT、CIP、SCF、CN)NS组的比例高于S组,差异有统计学意义(P 0.05)。外排泵adeB基因mRNA的RE值在上述各抗生素NS组和S组之间差异有统计学意义(P 0.
3、05)。外膜蛋白omp25、omp33-36、carO基因平均RE值均超过1.0,提示相对表达量升高。结论本院鲍曼不动杆菌对多种抗生素耐药率较高。外排泵基因adeB过度表达在本院鲍曼不动杆菌耐药中起着重要作用;其余外排泵基因adeJ、adeG、craA、abeM、amvA和外膜蛋白基因omp25、omp33-36、carO在本研究的多数菌株耐药机制中可能不起作用。【关键词】鲍曼不动杆菌;耐药;外排泵;外膜蛋白【中图分类号】R378Analysis of efflux pump and outer membrane protein of multi drug resistant Acinetob
4、acter baumannii HUANG Yubo,ZHOU Yuqi,ZHENG Wenzheng,ZHU Jiaxin,YANG Hailing,WU Wenbin,ZHANG Tiantuo.Department of Respiratory and Critical Medicine,the Third Affiliated Hospital of Sun Yatsen University,Guangzhou 510630,ChinaCorresponding author:ZHANG Tiantuo Email: 【Abstract】Objective To analyze th
5、e sensitivity of Acinetobacter baumannii(A.baumannii)to common antibiotics,and to detect the expression level of efflux pump genes and outer membrane protein(OMP)genes and to explore the relationship between the expression of these genes and antibiotic resistance.Methods A total of 213 isolates of m
6、ultidrugresistant A.baumannii from the lower respiratory tract of inpatients from our hospital were collected.Susceptibility testing was conducted by KB disk diffusion method.According to the drug sensitivity test,they were divided into nonsensitive groups(NS groups)and sensitive groups(S groups).Th
7、e expression level of efflux pump genes(adeB,adeJ,adeG,craA,abeM,amvA)and OMP genes(omp25,omp3336,carO)were detected by fluorescence quantitative PCR,and the differences of these genes between NS groups and S groups were compared.Results The insensitive rates of A.baumannii to amikacin and imipenem
8、were 89.2%and 81.2%respectively,and the insensitive rates to piperacillin/tazobactam,cefoperazone/sulbactam and gentamicin were more than 92%.The distribution of increased relative expression of adeB gene(RE1)in NS and S groups of antibiotics(AMK,IPM,CFP,FEP,TZP,CAZ,SXT,CIP,SCF,CN)was analyzed respe
9、ctively.The results showed that the proportion of RE 1 in most antibiotic NS groups was significantly higher than that in S groups,suggesting that the overexpression of adeB was closely related to the abovementioned antibiotic resistance.The RE values of adeB gene mRNA of efflux pump were significan
10、tly different in the following antibiotics(AMK,IPM,CFP,FEP,TZP,CAZ,医 学 检 查 与 临 床 诊 断doi:10.3969/j.issn.1006-5725.2023.16.019基金项目:广州市科技计划项目(编号:202206010127)通信作者:张天托 Email:2122实用医学杂志 2023年第39卷第16期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.16CIP,SCF,CN)between NS groups and S groups respectively
11、.The RE values of efflux pump genes(adeJ,adeG,craA,abeM and amvA)in the two groups had no elevation,and there was no statistical difference between the two groups by comparative analysis.The average RE values of OMP genes(omp25,omp3336,carO)were all more than 1.0,indicating an increasing of relative
12、 expression.Conclusion The A.baumannii is highly resistant to many kinds of antibiotics.The overexpression of efflux pump gene adeB plays an important role in drug resistance of A.baumannii in our hospital,while other efflux pump genes(adeJ、adeG、craA、abeM、amvA)and OMP genes(omp25,omp3336,carO)may no
13、t effect in most isolates of the drug resistance mechanism in this study.【Key words】Acinetobacter baumannii;drug resistance;efflux pump;outer membrane protein鲍曼不动杆菌是医院内重要的病原菌,由于其在医院环境中的生存能力和迅速获得抗生素耐药性的倾向,已成为临床和耐药菌流行的重要原因1。鲍曼不动杆菌在危重患者中可引起各种感染,包括肺炎、血流感染和尿路感染,其中呼吸机相关性肺炎和血液感染最为常见,病死率可达35%2-3。2017年,世界卫生组
14、织提出,开发针对耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的新型抗生素是当务之急4。多重耐药鲍曼不动杆菌的出现和传播对全球的健康已经构成了重大的威胁,对临床抗感染治疗提出了重大挑战5。既往研究表明,外排泵和外膜蛋白的表达和鲍曼不动杆菌出现多重耐药(MDR)具有高度密切的关系6-7。因此,本研究旨在了解本院鲍曼不动杆菌外排泵(efflux pump)和外膜蛋白(outer membrane proteins,OMPs)基因的表达情况,探讨其在本地区鲍曼不动杆菌耐药中的变化和影响,为临床诊治提供理论依据。1材料与方法1.1菌株来源收集中山大学附属第三医院住院患者下呼吸道标本分离的鲍曼不动杆菌共213株(2009年1
15、月至2014年3月),上述菌株由呼吸与危重症医学科实验室-80 冰箱低温保存。根据菌株对不同抗生素的敏感性分为不敏感组(NS 组)和敏感组(S组)。1.2 菌种鉴定 上述临床下呼吸道样本分离培养的213株鲍曼不动杆菌菌株常规经API 20NE初步鉴定后,再用分子生物学方法对其进行菌种鉴定,具体方法参照HIGGINS等8-9建立的gyrB多重PCR方法进行。以大肠埃希菌ATCC 25922、鲍曼不动杆菌ATCC 17978作为研究的对照。1.3 主要试剂和仪器 抗生素药敏纸片:阿米卡星(Amikacin,AMK),亚胺培南(Imipenem,IPM),头 孢 哌 酮(Cefoperazon,CF
16、P),头 孢 吡 肟(Cefepime,FEP),哌拉西林/他唑巴坦(Piperacillin-tazobactam,TZP),头孢他啶(Ceftazidime,CAZ),复方新诺明(SXT),环丙沙星(Ciprofloxacin,CIP),头孢哌酮/舒巴坦(Cefoperazone-sulbactam,SCF),庆大霉素(Gentamicin,CN),多粘菌素 B(Polymyxin B,PB),替加环素(Tigecycline,TGC)等,以上抗生素纸片均购自英国 OXOID 公司。主要试剂:LightCycler 480 SYBR GreenMaster(Roche 公司,瑞士);Tra
17、nscriptor cDNA Synth.Kit 1(Roche公司,瑞士);RNAiso Plus(TaKaRa公司,中国大连)。主要仪器:PCR 扩增仪9700型(Applied Biosystems公司,美国);核酸蛋白分析仪 DU 730 型(BECKMAN 公司,美国);RT-PCR 仪 LightCycler 480 型(Roche公司,瑞士)。1.4方法1.4.1药敏试验药敏试验采用纸片扩散法(K-B法)。根据美国临床实验室标准化研究所(CLSI)公布的2012年版标准对药物的敏感性进行判断,以大肠埃希菌 ATCC 25922、铜绿假单胞菌 ATCC 27853作为药敏对照质控菌
18、株10。所有操作均严格按照标准规程进行。部分抗生素敏感性参考EUCAST2012标准。1.4.2RNA 提取及 cDNA 的合成按照 RNA 提取试剂盒(RNAiso Plus,TaKaRa,Code No.9108/9109)提供的方法进行总 RNA 提取,结合预实验结果作适当的改进。按照试剂盒(Cat.No.04 897 030 001)提供的方法进行cDNA的合成(逆转录)。根据下列表 1 中相关研究提供的方法,结合预实验结果选择引物序列进行荧光定量PCR。其中引物的合成委托英潍捷基(上海)贸易有限公司进行。以基因rpoB作为内参基因,检测外排泵基因(adeB、adeJ、adeG、cra
19、A、abeM、amvA)、外膜蛋白基因(omp25、omp33-36、carO)的表达水平,参考引物序列具体见下列表1。1.4.3相关基因mRNA相对表达量的计算根据荧光定量 PCR 试剂盒(LightCycler 480 SYBR Green Master)提供的方法进行操作。内参基因 rpoB及各目的基因扩增曲线与溶解曲线均为单峰曲线,表明实验重复性良好且没有非特异性扩增。以鲍曼不动杆菌 ATCC 17978 标准株相应基因mRNA 表达量作为参考对照。具体计算公式为mRNA相对表达量(relative expression,RE)=2-Ct,2123实用医学杂志 2023年第39卷第16
20、期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.16Ct=(CtTarget-CtrpoB)目的菌株-(CtTarget-CtrpoB)对照菌株。1.5统计学方法本研究使用Excel 表建立研究的数据库,以 SPSS 22.0 版软件进行统计学处理和分析。正态分布的计量资料描述采用均数标准差(x s),采用独立样本t检验或者单因素方差分析(One-way ANOVA)进行比较;非正态分布的计量资料的描述采用中位数(median,M),采用秩和检验进行比较。定性资料采用 2检验进行比较。P 0.05为差异有统计学意义。2结果2.1菌株的药敏结
21、果经分离培养鉴定的213株鲍曼不动杆菌对主要抗生素的耐药情况如下(见表 2):上述菌株对阿米卡星、亚胺培南不敏感率分别为 89.2%、81.2%,对头孢哌酮、头孢吡肟、哌拉西林/他唑巴坦、头孢他啶、复方新诺明、环丙沙星、头孢哌酮/舒巴坦、庆大霉素的不敏感率均超过92%,对多粘菌素B和替加环素均敏感。2.2外排泵和外膜蛋白基因表达水平研究外排泵基因、外膜蛋白基因表达水平与抗生素耐药之间的关系,检测外排泵基因(adeB、adeJ、adeG、craA、abeM、amvA)、外膜蛋白基因(omp25、omp33-36、carO)的mRNA的表达水平。根据各菌株对抗生素的敏感性分组,比较不敏感组(NS
22、组)与敏感组(S组)在上述基因表达水平的差异。根据各菌株外排泵基因表达量与标准鲍曼不动杆菌ATCC 17978比较,计算上述基因mRNA相对表达量(relative expression,RE),具体算法见1.4.3。由于表2213株鲍曼不动杆菌耐药情况Tab.2Susceptibility of 213 strains of A.baumannii to antimicrobial agents株(%)抗生素AMKIPMCFPFEPTZPCAZSXTCIPSCFCN不敏感190(89.2)173(81.2)207(97.2)207(97.2)209(98.1)207(97.2)196(92.
23、0)207(97.2)201(94.4)204(95.8)敏感23(10.8)40(18.8)6(2.8)6(2.8)4(1.9)6(2.8)17(8.0)6(2.8)12(5.6)9(4.2)表1荧光定量PCR引物序列表11-14Tab.1Primers for fluorescent quantitative PCR基因rpoBadeBadeJadeGcraAabeMamvAomp25omp33-36carO引物rpoB_rtRevrpoB_rtForadeB_rtForadeB_rtRevadeJ_rtForadeJ_rtRevadeG_rtForadeG_rtRevcraA_rtFor
24、craA_rtRevabeM_rtForabeM_rtRevamvA_rtForamvA_rtRevomp25_rtForomp25_rtRevomp33-36_rtForomp33-36_rtRevcarO_rtForcarO_rtRev序列(5-3)ATGCCGCCTGAAAAAGTAACTCCGCACGTAAAGTAGGAACCTTGCATTTACGTGTGGTGTGCTTTTCTACTGCACCCAAAGGTCATTAATATCTTTGGCGGTACGAATACCGCTGTCAGTGTAGTGCCACTGGTTACTATGTGGGCTAGCTAACGGCTTCATTGCTTGCGCCT
25、TTCCAGTGCCATGAAACATAATCAAGGGACGTATTATGGCGAAACTGCTGTGCTTAGACCAATTTTTGCAGAGAAATTTTGCACTTGGCGACTAATGGACCAAAAGCTGCGAACGTGAAATCGACAACACGTAACCTTTAACACCTAGAGCAAGCAAGTGTTGCTAACCAATTCGCTGTTTTCTTGACCGAATGCACCTGTTCATGACAGCTATGCATTCGATACCCAATGCTAAACCTACATATGGGT2124实用医学杂志 2023年第39卷第16期 The Journal of Practical M
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