药学分子生物学实验1.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验基本操作,微量高速离心机（样品分离）,移液器（微量取液）,混匀方式（震荡、轻弹、吹吸）,微量高速离心机操作,装液（,1.5ml,离心管或,0.2ml PCR,管）,标记,(,记号,笔,),平衡（等体积相同管）,放置（,对称,！）,离心（时间按钮，转速按钮）,注意：缓慢转动，记录时间,停止（转速按钮回零，时间按钮回零，完全停止后,轻轻,取出离心管）,移液器规范操作,工作原理：,含内置活塞，通过,弹簧,的伸缩运动，推动空气，实现吸液和放液。,实验结束时将移液器调至最大量程！,移液器规范操作,第一步,:,设定移液体积,第二步,:,装配移液器吸头,垂直插入吸头，左右微微转动，上紧。,第二步：装配移液器吸头,轻取吸头，左右转动,第三步,:,吸取液体,正向吸液,移液器按钮分,2,档：,I,档：吸液；,II,档：放液,垂直吸液,吸头尖端需浸入页面,3mm,以下,缓慢吸液,第四步,:,放液,完全打出，吸头尖靠内壁，排出最后的液滴；,按钮待液体完全打出后再放松,血清和粘性液体的吸液和放液速度都要保持缓慢,用大量程的移液器移取小体积的液体,装配吸头时气密性不好，吸头不匹配,吸液速度和放液速度太快,自我检测漏气：,吸取液体，垂直静置,5,秒，观察是否有液滴流出；,规范操作，损坏赔偿！,移液不准确的常见原因：,废弃物的处理,吸头，放置在塑料袋中,废液，倒在废液缸中,实验中所有的废弃物集中高压灭菌后再丢弃,实验报告,1,.,原理,2,.,操作步骤,3,.,实验结果,4,.,思考题,实验,1,质粒,DNA,的提取,碱裂解法,质粒（,plasmid,）,独立于染色体外，非宿主生长所必需，能进行复制和遗传的辅助性遗传单位（小型双链环状,DNA,）。,菌体在,NaOH,和,SDS,溶液中裂解时，,DNA,（质粒,DNA,和染色体,DNA,）发生变性（强碱破坏碱基配对）,加入酸性液中和后，闭环质粒,DNA,链能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；染色体,DNA,不能复性，沉淀下来。,碱裂解法抽提质粒,DNA,原理,利用质粒,DNA,和染色体,DNA,在拓扑学上的差异达到分离目的,收集细菌，吸取,1ml,菌液，,10000rpm/5min,，弃上清。,加入,100ul,溶液,I,（,EDTA,葡萄糖、,Tris-HCl,）,，在震荡器上重新悬浮沉淀。,加入,200ul,溶液,II,（,NaOH,SDS,），盖上盖子，颠倒混匀,5,min,。打在盖子可见拉丝现象。,加入,150ul,溶液,III,（醋酸、醋酸钠），盖上盖子，颠倒混匀后插冰上冰浴,5min,。可见白色沉淀（基因组,DNA,、变性蛋白质,SDS,的混合物）。,10000rpm/5min,，将上清转移至新的,EP,管中。,以上步骤实现了质粒,DNA,与基因组,DNA,的分离,操作步骤,6.,加入,500ul,酚氯仿混合液，盖上盖子后，摇晃管子混合液体，放置室温,5min,。,7,.,10000rpm/5min,，将上清转移至新的,EP,管中。,注意：,不要吸取中间的白色沉淀。,以上步骤实现了去除蛋白质的作用。,8.,加,2.5,倍体积预冷的无水乙醇,，混匀，冰浴,10min,，,12000 rpm/5 min,；,9.,弃上清,，,沉淀加,1ml,预冷的,70,乙醇,洗涤，,10000 rpm/5min,；,以上步骤沉淀并洗涤质粒,DNA,10.,弃尽上清，沉淀于温箱干燥后，加,30,l TE,溶液溶解，,50,水浴,10min,后,-20,保存。,TE,溶液,（,TrisHCl,，,EDTA,Rnase A,酶,),实验,2,聚合酶链反应（,PCR,）扩增质粒,DNA,PCR,扩增重组质粒,DNA,的,GAPDH,基因片段,重组质粒,DNA,目的基因,GAPDH,（,205bp,）,质粒载体,2692bp,A,PCR,反应体系（,20 l,）,ddH,2,O 14.0,l 70 l,10 x,缓冲液（,10 x b,）,2.0 l 10 l,dNTP 2.0 l 10 l,primer 1(P1)0.4 l 2 l,primer 2(P2)0.4 l 2 l,Taq,酶,0.2 l 1 l,质粒,DNA,（,50100ng/l)1.0 l,混合体系,19l,x5,空白对照：以,ddH,2,O,替代质粒,DNA,模板,PCR,反应程序,预变性,94 2min,变性,94 20s,退火,55 20s,延伸,72 20s,充分延伸,72 5min,30cycles,紫外投射分析仪,实验,3,限制性核酸内切酶酶切质粒,DNA,简称限制酶，是一类能识别和切割双链,DNA,分子内,特定碱基顺序,的,核酸内切酶,，为原核生物所特有。,型限制酶被称为基因工程的分子剪刀。,限制性核酸内切酶,（,restriction endonuclease,RE,）,限制性核酸内切酶,作用模式,:,在,特定的位点,上精确切割双链,DNA,分子，产生特异末端的,DNA,片段。,识别序列：,双链,DNA,特异的,碱基对,(,一般,4,6,个,),在识别序列内,特,异切割,DNA,磷酸二酯键断裂,载体,:,能将外源,DNA,片段导入宿主细胞进行扩增或表达的工具。本质为,DNA,。,基本特征：,能,自我复制,并具较高的拷贝数。,带有,遗传筛选,标记（抗药性、酶基因等）,。,有适当的,限制酶切位点,，便于外源基因的插入和筛选,重组质粒,DNA,目的基因,GAPDH(205bp),质粒载体,2692bp,重组,质粒载体,2897bp,CAGCTG,GTCGAC,Pvu II,酶切产物：,535bp,2362bp,(Pvu II),(Pvu II),Pvu II,限制酶切反应体系（,20 l,）,ddH,2,O 10,l,10 x,缓冲液（,10 x b,）,2 l,重组质粒,DNA 7 l,Pvu,II 1 l,混匀，,37,水浴,1h,加样注意事项：,1.,直接加到液体里面，不要加到管壁上,2.,加完后保持液体在管底，勿使液体溅起,限制性内切酶反应影响因素：,DNA,的纯度和结构,反应缓冲液的,pH,值及离子浓度,酶解温度和时间,限制酶质量,根据特异识别序列切割,DNA,片段,用于基因组计划研究（物理图谱，基因定位，,DNA,同源性分析,DNA,甲基化碱基的识别与切割）,限制性片段长度多态性（,restriction fragment length polymorphism,RFLP,）研究，用于法医学个体识别和遗传性疾病的诊断,限制性内切酶用途：,“,分子剪刀”,二、,限制性,片段,长度,多态性,分析,（,RFLP,restriction frgment length polymorphism,）,基因突变导致碱基组成顺序发生改变，会在基因结构中产生新的,限制性核酸内切酶位点,或使原有限制性核酸内切酶位点消失。,因此，,突变基因,经相应的,限制性核酸内切酶,水解后，其电泳,条带的数量和大小就会发生改变,，根据这些改变可以判断突变是否存在。即限制性片段长度多态性技术。,苯丙酮尿症（,PKU,）,苯丙氨酸羟化酶,PAH,活性降低或其辅酶缺乏，导致苯丙氨酸向酪氨酸代谢受阻，尿中苯丙氨酸旁路代谢产物苯丙酮酸、苯乙酸和苯乳酸显著增加。,我国,PKU,患病率约为,1:10000,。,约,3/4,经典型,PKU,患者的,PAH,基因发生点突变,。,PKU,产前诊断,：,怀孕,16,20,周时抽取羊水，检测羊水中胎儿细胞中是否带有致病基因突变位点。,实验,4,琼脂糖凝胶电泳鉴定,核酸产物,琼脂糖：,琼脂糖是从琼脂中提取出来的，由,D-,半乳糖和,3,6-,脱水,-L-,半乳糖组成的链状多糖分子，可以形成具有刚性的网孔状凝胶。琼脂糖的浓度决定凝胶孔径的大小。,琼脂糖凝胶电泳原理：,DNA,分子在碱性缓冲液中带负电荷，在电场作用下向正极泳动。,琼脂糖凝胶电泳法分离鉴定,DNA,，主要是利用,分子筛效应,。线性双链,DNA,分子迁移率与其分子量的对数值成,反比,。,不同大小和构象的,DNA,分子在相同的电泳条件下，通过凝胶的迁移率不同，所以可通过电泳使其分离。,1,2,3,4,5,6,上样缓冲液,(Loading Buffer),上样缓冲液组成：,电泳指示剂与蔗糖,(,或甘油,),组成上样缓冲液,电泳指示剂：,溴酚兰（紫兰色）,二甲苯青（兰色）,上样缓冲液作用：,1,）使样品呈色，便于加样操作,2,）增加样品密度和比重，以确保,DNA,样品均匀沉入加样孔内,3,）在电泳中形成肉眼可见的指示带，可判断,DNA,电泳的速度和位置,荧光染料,(SYBR Green I),SYBR Green I,荧光染料,SYBR Green I,嵌入,DNA,的碱基平面后，本身无荧光的,DNA,在紫外光激发下发出荧光，且荧光强度与,DNA,含量呈正比。,DNA,分子标准物,(DNA Marker),DL2000,1 kb DNA Ladder,100 bp DNA Ladder,琼脂糖凝胶电泳：,琼脂糖凝胶电泳,优点,：,操作简便,电泳速度快,透明而不吸收紫外线，电泳后易染色和回收,琼脂糖结构均匀，以其作为介质进行电泳得到的,DNA,条带清晰、分辨率高、重复性好,琼脂糖凝胶电泳,应用,：,核酸分离鉴定,(,质粒,DNA,分析,),核酸产物分析,(PCR,产物分析；,DNA,酶切图谱分析,),核酸纯化回收,(,基因克隆,),影响,DNA,电泳迁移率的主要因素：,DNA,的分子大小：,线性双链,DNA,分子通过凝胶的速率与其分子量的常用对数成反比。,DNA,的分子构象：,相同分子量的闭环,(,型,),，开环,(,型,),和线状,(,型,),的,质粒,DNA,，在琼脂糖凝胶中电泳速率不同。迁移率,型,型,型。,琼脂糖凝胶的浓度：,一定大小的,DNA,片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移率不同。在一定浓度的琼脂糖凝胶中，不同大小的,DNA,片段的迁移率也不同。,电场强度和离子强度,线性双链,DNA,分子迁移率与其相对分子量成反比：,M 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2,100 bp 200 bp 300 bp 500 bp 1000 bp,电泳方向,正极,负极,相同分子量不同构型的,DNA,分子迁移率不同：,三种构型的质粒电泳模式图谱,超螺旋,线性,开环,加样孔,开环,线性,超螺旋,琼脂糖凝胶浓度,(%),线性,DNA,分子的有效分离范围,(kb),0.6,1.0-20,0.7,0.8-10,0.9,0.5-7,1.2,0.4-6,1.5,0.2-4,2.0,0.1-3,琼脂糖凝胶浓度和,DNA,分子的有效分离范围：,PCR,产物电泳图：,300bp,引物二聚体,目的片段,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14,1.DNA marker,2-13.PCR,扩增产物,14.,空白对照,质粒,DNA,电泳图：,DNA Marker,质粒,DNA,样本,1,质粒,DNA,样本,2,质粒,DNA,样本,3,1 2 3 4,质粒,DNA,酶切产物电泳图：,1 2,DNA Marker,质粒,DNA,酶切产物,750bp,500bp,2000bp,琼脂糖凝胶电泳操作步骤：,样品：,PCR,产物,10 l,加,上样缓冲液,2 l,，加,Sybr Green I,(SG),2 l,，混匀,取,10 l,加入加样孔中,(,记录样品次序,),110V,稳压，电泳约至凝胶,2/3,处,紫外灯下观察结果,(,与,DNA Marker,比较,),记录并画出示意图,注意：,加样时持移液器的手以肘部固定在桌上，用另一只手扶住这只手的手腕，以减少移液器的抖动。加样器吸头应恰好置于凝胶点样孔中，不可刺穿凝胶，也要防止将样品溢出孔外造成邻孔之间相互污染。,琼脂糖凝胶电泳操作步骤,样品：,PCR,产物,(,混匀后吸取）,8l,；,加,上样缓冲液,1l,，加,Sybrgreen,1l,，混匀（,Marker 5l,只加,Sybrgreen 1l,）；,加入加样孔；,100V,稳压，电泳至凝胶,2/3,处；,紫外灯下观察结果（样品与,DNA Marker,比较）；,记录并画出示意图。,DNA,分离、纯化、鉴定的常用方法；,电荷效应；,分子筛效应,；,分离,分子量,/,构型（构象）不同,的,DNA,分子,琼脂糖凝胶电泳,-,+,琼脂糖凝胶电泳,样品,加上样缓冲液,(,示踪指示剂,),，加,SYBR green I,（,荧光染料,），混匀；,上样缓冲液包含二甲苯青（相应于,2KbpDNA,）和溴酚蓝（相应于,20bpDNA,）两种染料,荧光染色原理,核酸的荧光染料如溴化乙锭（,EB),、,SYBR Green I,等嵌入碱基平面后，本身无荧光的核酸在,UV,激发下发出荧光。,荧光强度的积分与溶液中核酸的含量呈正比,（,SYBR Green I,具有双链,DNA,的专一选择性；,EB,则与单链、双链甚至三链,DNA,均可高效结合）。,SYBR Green I,工作原理,SYBR GreenI,能结合到双链,DNA,的小沟部位,紫外灯下发出荧光,SYBR Green,紫外投射分析仪,实验,3.3,琼脂糖凝胶电泳鉴定,质粒,DNA,及酶切产物,琼脂糖凝胶电泳操作步骤,样品：,质粒,DNA,10l;,酶切产物,10l,；,分别加上样缓冲液,2l,，加,SYGR green I 2l,，混匀；,取,10l,加入加样孔中；,110V,稳压，电泳至凝胶,2/3,处；,紫外灯下观察结果（与,DNA Marker,比较）；,记录并画出示意图。,重组质粒,DNA,目的基因,GAPDH,（,205bp,）,质粒载体,2692bp,重组质粒载体,2897bp,A,Pvu II:,CAGCTG,GTCGAC,535bp,2362bp,限制酶切产物分析,1 2 B,限制性内切酶反应影响因素：,DNA,的纯度和结构,反应缓冲液的,pH,值及离子浓度,酶解温度和时间,限制酶质量,思考题,溶液,I,，,II,，,III,的作用？,苯酚，氯仿，异戊醇的作用？,无水乙醇，,70,乙醇的作用？,TE,溶液（,pH8.0,）,RNase A,的作用？,思考题：,琼脂糖凝胶电泳鉴定,DNA,的基本原理？,影响,DNA,电泳迁移率的因素有哪些？,上样缓冲液的成分和作用？,