遗传实验05：人外周血培养与染.ppt

*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,1.,学习外周血淋巴细胞悬浮培养的原理和方法；,2.,利用培养后进行分裂的细胞制备人类染色体标本；,3.,利用人类染色体核型分析软件进行核型分析。,一、实验目的：,二、实验原理：,1,、植物血凝素的作用,外周血中的淋巴细胞几乎都是处在,G,0,或,G,1,期，一般情况下是不分裂的。当在培养基中加入,植物血凝素,(PHA),时，这种小淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞，进而开始进行有丝分裂。,2,、秋水仙素的作用：,秋水仙素,(colchicine),可以抑制细胞纺锤体的形成，使处在分裂的细胞停留在中期。因此利用秋水仙素处理可以获得许多同步的中期分裂细胞。,使用秋水仙素处理会引起染色体在一定程度上的收缩，因此在处理时间和浓度上要合适。,带型,（,banding pattern,）,即染色体带型。借助细胞学的特殊处理程序，使染色体显现出深浅不同的染色带。染色带的数目、部位、宽窄和着色深浅均具有相对稳定性，所以每一条染色体都有固定的分带模式，即称带型。,常用的显带技术所显示的带有,Q,带、,G,带、,C,带、,R,带、,T,带,等。就每一种分带技术而言，每一染色体的带型是高度专一和恒定的。,三、实验用具及试剂：,实验仪器及用具：,恒温培养箱、离心机、恒温水浴箱、冰箱、显微镜、显微数码摄像系统、染色体分析仪；,培养瓶、注射器,、微量移液器、枪头、,吸管、离心管,(10ml),、载玻片、烧杯、,量筒。,.,2.,实验试剂：,外周血淋巴细胞培养基,2%,碘酒,75%,酒精,20g/ml,秋水仙素,0.075 mol/L KCl,溶液,甲醇,冰醋酸,Giemsa,原液,1/15 mol/L,磷酸缓冲液,四、实验步骤：,1、,采血：,将皮肤常规消毒后静脉采血约 0.5 ml。,2、,种血及培养：,将采到的血样立即接种到培养瓶内，每个培养瓶接2528滴（约0.5ml），轻轻摇匀后将培养瓶放在37温箱中培养72小时。培养过程中，每天应轻轻摇动两次培养瓶。,3、,秋水仙素处理：,在终止培养前,3-,4小时，向培养瓶中加 20g/ml的秋水仙素2,0,l，轻轻摇匀后继续培养到72小时。,4,、制片：,（,1,）,离心：,从温箱中取出培养瓶，用吸管将培养液转入,10ml,的刻度离心管内。,2000,转,/,分，离心,10,分钟。,（,2,）,低渗：,弃去上清液。加入,37,预热的,0.075 mol/L KCl,低渗液,6-,8,ml,，用吸管轻轻吹打均匀，放在,37,恒温水浴中,40,分钟。,(,此时配固定液：甲醇,225ml+,冰醋酸,75ml),（,3,）,预固定：,在离心管中加入现配的预温的甲醇,-,冰醋酸,(3:1),固定液约,1ml,，轻轻混匀,，,37,固定,15,分钟。,（,4,）,再次离心,：,2000,转,/,分离心,10,分钟。,（,5,）,第一次固定,：弃上清液，加入固定液约,7ml,，立即用吸管吹打使之成细胞悬液，室温固定,20,分钟。,2000,转,/,分离心,10,分钟。,（,6,）,第二次固定,：同第一次固定。,（,7,）,弃上清液,，根据沉淀量的多少，加入适量固定液,6,8,滴，用吸管吹打使均匀后制成细胞悬液。,（,8,）,滴片：,在,30-40cm,高处将细胞悬液滴在预冷的载玻片上，注意动作应迅速，避免载片升温。,（,9,）,染色：,用,10%,吉姆萨染液扣染,30,分钟，染色结束后用清水将浮色冲去，干燥后即可进行镜检。,（,10,）,照相：,在显微镜下寻找分散较好的分裂相,(,核型,),，再置于显微照相仪下拍摄照片，并保存。,（,11,）,核型分析：,应用核型分析软件，进行染色体核型分析。,核型分析仪及核型分析,五、注意事项,:,1,、秋水仙素处理时间过长，分裂细胞多，染色体短小；反之，则少而细长。都不宜观察形态及计数。故秋水仙素的浓度及时间要准确掌握。,2,、低渗使红细胞膜破裂，淋巴细胞膨胀，低渗处理浓度及时间要适当。且低渗后混匀细胞一定要轻，否则引起膜破裂、染色体散失。,3,、离心前配平，离心速度过高，细胞团不易打散；反之，细胞易丢失。,4,、固定液应在使用前临时配制。,5,、载玻片一定要洁净，否则染色体分散不好。,六、实验结果与分析：,染色体核型分析：人类每个体细胞有,46,条染色体，,22,对常染色体和一对性染色体，男性为,46,，,XY,；女性为,46,，,XX,。,臂比值,符号,中间着丝粒染色体,11.7,m,近中着丝粒染色体,1.73,sm,近端着丝粒染色体,37,st,顶端着丝粒染色体,7,t,A,组（,No.1,3,）：是最大的一组染色体，它们的着丝粒在中部或几乎在中部，为中部着丝粒染色体；,B,组（,N0.4,5,）：为两对大的亚中部着丝粒染色体，它们有明显的长臂和短臂；,C,组（,N0.6,12+X,）：为中等大小的亚中部着丝粒染色体，它们大小相差不多，,X,染色体大小介于期间，一般难以区分；,D,组（,N0.13,15,）：为中等大小的近端着丝粒染色体，它们的一个重要形态特征是随体，随体是一对着色很深的小球，处于短臂的末断，随体与短臂之间的区域很少着色；,人类染色体分组,E,组（,N0.16,18,）：包括一对中着丝粒染色体（,16,）和两对亚中着丝粒染色体（,17,、,18,）；,F,组（,N0.19,20,）：为两对小的中部着丝粒染色体；,G,组（,N0.21,22+Y,）：为最小的一组近端着丝粒染色体，在,N0.21,22,的短臂上可见随体。,Y,染色体常呈现异固缩状态，着色更深，可以识别。,人类染色体核型分析结果,重要参数：,（,1,）染色体的相对长度,（,2,）臂比率,（,3,）着丝点指数,七、作业及思考题：,1,、将分散良好的标本进行显微照相；,2,、观察人类染色体的形态、结构特点；,3,、对比男性和女性的染色体标本，比较异同；,4,、总结做好本实验的关键因素。,八、参考文献：,医学遗传学基础与临床,.,程在玉，伦玉兰,.,山东：青岛出版社，,1993.,遗传学实验教程,.,王建波，方呈祥等编,.,武汉：武汉出版社，,2004.,外周血培养染色体失败的原因分析,.,李庆，王秉仪，洪美玲等,.,解放军医学高等专科学校学报，,1999(1),：,72.,（完）,核型,带型,返回,正常男性核型,G,A,B,C,D,E,F,返回,