第四章细胞工程制药.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,作业,分别列出1种动物细胞、植物细胞工程制药的实例,细胞工程,指以细胞为研究对象，通过细胞培养获得自然界难以获得的珍贵产品的新兴生物技术。,微生物、动物、植物细胞培养特性,细胞种类,微生物细胞,植物细胞,动物细胞,细胞大小（um）,110,20300,10100,倍增时间（h）,0.35,大于12,大于15,营养要求,简单,复杂,复杂,对剪切力,不敏感,敏感,敏感,光照要求,不要求,要求,不要求,主要产物,氨基酸、抗生素、核苷酸、有机酸,色素、次生代谢产物,疫苗、抗体、多肽,第一节、动物细胞工程制药基本技术,一、动物细胞培养技术：,概述,、,仪器设备,、,培养基,、,培养方法,、,种质保存,、,大规模培养技术,二、动物细胞,融合技术,及单克隆抗体制备（略）,三、转基因动物技术（略）,四、核移植及动物克隆技术（略）,五、干细胞技术（略）,动物细胞方法,（一）,组织块培养法,（二）,细胞单层培养法,（三）,单细胞微量板克隆技术,动物细胞培养概述,动物细胞与组织培养,是从动物体内取出细胞或者组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或者组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。,培养细胞的特性,悬浮型,血液、淋巴细胞、杂交瘤细胞,贴壁型,：,A上皮细胞型,B成纤维细胞型,C游走细胞型,D多形细胞形,（1）动物细胞,贴壁生长,特性,（2）动物细胞,接触抑制,特性,兼性贴壁型,：,动物培养细胞的,优点,（1）,细胞经培养后形成的细胞系和细胞株，特征均一。,（2）理化环境可控制，培养物可直接被观测。,（3）提供大量均一的细胞供制备用。,（4）便于进行人工筛选。,（5）结合显微电影技术，可观察细胞代谢活动和反应。,应用：,（,1,）生产有重要价值的蛋白质产品 分泌性的蛋白质产品,（,2,）培养皮肤细胞用于移植 形成组织,（,3,）检测有毒物质 致癌致畸引起染色体数目和结构改变,（,4,）理论研究 培养正常或异常细胞用于生理、病理、药理研究,（1）动物细胞贴壁生长特性,（2）动物细胞接触抑制特性,细胞从接种到长满底物表面后，由于细胞繁殖数量增多相互接触后，不再增加。,动物细胞培养所需仪器设备,实验室要求,（A）和缓冲间相连，缓冲间内备消毒服装和鞋，口罩等，入内换上。,（B）室内空气不流通，有适当的光线，清洁，干燥.,万级。,（C）侧部可设传递窗，用于物品传递。,（D）有消毒用紫外线灯,（1）,培养器具,（2）,超净工作台,（3）,CO,2,培养箱,（4）,倒置显微镜,（5）,纯化水装置,（1）培养器具,培养瓶,培养板,培养皿,（2）超净工作台,超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。,100级超净工作台指标：,（0.5m3.5粒/L）,（3）CO,2,培养箱,CO,2,培养箱设定的条件为37 ，5CO,2,。,二氧化碳的作用：细胞生长需要、维持pH值。,（4）倒置显微镜,（5）纯化水装置,动物细胞的培养基,动物细胞的培养基组成-氨基酸、葡萄糖、蛋白质、核酸类物质、维生素、辅酶、激素、生长因子、微量元素、缓冲系统。,1、,培养细胞的培养液要求,2、,天然培养基,3、,合成培养基,4、,无血清培养基,1、培养细胞的生存环境,适宜的温度-人和哺乳动物培养细胞最适温度均为3537。,气体环境和氢离子浓度-需要一定量的O,2,和CO,2,（95空气+5%CO2）；pH7.2-7.4,营养物质-,适当的培养基,环境无毒和无菌：双抗、消毒,渗透压：,培养液要求,氨基酸-,氮源,盐类-钠离子，钾离子，镁离子，钙离子，氯离子，硫酸根离子，磷酸根离子，碳酸氢根离子等 葡萄糖：供能,缓冲系统-CO2缓冲系统或HEPES（羟乙基哌嗪乙硫磺酸）,生长因子-PDGF，EGF，FGF等,其它成分-维生素，矿物，有机补充物，激素等,平衡盐溶液（,BSS,）,功效：,维持渗透压,提供缓冲系统,提供水分和无机盐,4、,天然培养基,天然培养基如-血清，血浆，组织浸出液等,优点-营养成分丰富，培养效果好,缺点-来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染,天然培养基的类型：,A乳蛋白水解物培养基,B酪蛋白水解物培养基,C血清及胚胎浸出液培养基,5、,合成培养基,合成培养基-是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。,优点-标准化生产，组分和含量相对固定，成本低。,缺点-缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。目前常用合成培养基血清来培养细胞,合成培养基的类型：,（A）Eagle培养基（内含13种氨基酸、9种维生素、多种无机盐）,（B）Ham氏F10培养基（内含20种氨基酸、多种维生素、10种无机盐）,（C）199培养基,（D）Waymouth氏MB752/1培养基,（E）NCTC109培养基,6、无血清培养基,无血清培养基-在合成培养基中加入起血清作用的种类激素和生长因子，如铁转运蛋白、乙醇胺、胰岛素、硒、氢化可的松、维生素C、促胃激素等等。,血清的成分：,激素：胰岛素、胰高血糖素、生长激素、孕酮、氢化可的松、雌二醇等,生长因子：表皮生长因子、神经生长因子、成纤维生长因子、血小板生长因子,结合蛋白：白蛋白、转铁蛋白等,贴壁和铺展因子物质：如纤维粘连素、多聚赖氨酸、胶原、血清铺展因子等。,多种金属离子,低分子量营养因子：维生素A、维生素C、脂肪酸等,不明成分,动物组织块培养法,将动物组织切成直径为12mm的小块、并且进行培养的方法称为动物组织块培养法。有些动物组织如人的皮肤细胞，由于分散成细胞十分困难，因此常常采用组织块培养法。,动物组织块固着之后，加培养液，于37,、CO,2,培养箱中、通入含5%CO,2,的空气进行培养，即可在组织块周围长出新的细胞单层。动物组织培养过程中，进行旋转或者振荡，培养效果更好。,动物细胞单层培养法,动物组织块经过胰蛋白酶消化分散成单细胞或者细胞团块之后，粘附于培养基中，培养成新生细胞单层的方法称为动物细胞单层培养法。,动物细胞单层培养法包括二个过程：,1、,组织块分散成单细胞,2、,培养,1、组织块分散成单细胞,消化分散组织块的方法分为三种：,（1）酶消化法,（2）物理分散法,（3）酶消化与物理分散结合法,2、培养,上述细胞悬液经过计数、稀释之后，接种于无菌培养器中，加入培养液于37,条件下培养,，细胞即粘于瓶底或者转瓶内壁，并且开始生长形成单层。,接种浓度：上皮细胞1*10,5,3*10,5,个/毫升。成纤维细胞2*10,5,6*10,5,个/毫升。成体细胞应高于胚胎细胞。,培养时间：上皮细胞57天形成单层。成纤维细胞34天形成单层。,培养条件：动物细胞的需氧量较低，一般通入含5%CO2的空气进行供氧，有利于维持培养基的PH值。,培养方法,（1）,原代培养,（2）,传代培养,（1）原代培养,定义：从新鲜供体取得组织细胞后在体外进行首次培养，一般持续14周。,原代细胞,：直接将动物组织和器官经过粉碎、消化而制得的悬浮细胞,步骤：取材-组织分离,原代细胞,-培养,（2）,传代培养,定义：当原代培养的细胞相互汇合时，细胞由原培养瓶消化、收集、稀释后传到新的培养瓶的过程。,注意：原代细胞类型不一，利用不同的消化时间和消化液。,细胞系-原代培养物首次传代成功后即成细胞系。,A有限细胞系：,传代细胞系,B连续细胞系：,转化细胞系,传代细胞系,：又称,二倍体细胞系,，原代细胞经过传代、筛选、克隆等步骤，从多种细胞中纯化得到的某种具有一定特征的细胞系。,步骤：,A贴壁细胞：去除培养基-胰蛋白酶消化-加入培养液，形成细胞悬液-,稀释传代细胞系,-培养,B悬浮细胞：收集细胞悬液-离心搜集细胞-用培养液稀释-,稀释传代细胞系,-培养,传代细胞：,（1）具有二倍性染色体（2n），染色体核型正常。,（2）具有明显的贴壁依赖、接触一致性,（3）培养条件下一般可联系传代50代，不能进行无限期的分裂繁殖。,（4）无致癌性。,目前已获得了多种人胚胎肺二倍体细胞，来源于3-4个月的胚胎肺组织，如：,W1-38；MRC-5；MRC-9；IMR-90；2BS；KBM-13；LS-7,转化细胞系,：正常细胞经过某个转化过程，失去正常细胞的特点而获得无限增殖能力的细胞系。,特征：原代细胞相比，其形态、染色体结构、倍增时间、营养要求、生理生化特性、病毒敏感性、抗原性、上均发生了变化，并且具有致癌性。,来源：自然转化；人为转化；肿瘤组织,目前已经获得的确立细胞系有：,ABHK-21细胞 地鼠幼鼠肾脏,BHela细胞 人子宫癌细胞,CVero细胞 非洲绿猴肾脏细胞,DCHO细胞 中国仓鼠卵巢细胞,ENamalwa细胞 肯尼亚淋巴瘤病人,转化细胞系,单细胞分离培养,单细胞分离培养也称为细胞克隆培养，是指将单个细胞培养成纯细胞系群的技术。,由于动物细胞具有集群效应，单个细胞在培养基中难以生长。因此在克隆株培养过程中，常常采用：,（1）使用条件培养基进行培养。,（2）在培养基中加入饲养细胞-如加入小鼠胸腺细胞和小鼠腹腔巨噬细胞。,单细胞微量板克隆技术,1、,微量板克隆技术,2、,单细胞微量板克隆技术的特点和应用,1、微量板克隆技术,微量板是指孔径为6mm，容量为0.3ml的多孔培养板。常用的有96孔、55孔、24孔。,细胞克隆时，将细胞稀释成10个/毫升以下的悬浮液，然后向每1微孔中加入0.1毫升，则每1孔中的细胞数平均为1个。接种后在含5%CO2的空气的培养箱中进行培养，每隔48天更换一次新的培养液0.2ml，直到形成单克隆细胞株。,继代培养时，吸除培养液，用不含Ca、Mg的平衡盐溶液冲洗，再用胰蛋白酶进行消化，然后用培养液洗涤，再转移到25cm,2,表面的培养瓶中，加3ml培养液进行培养，几天后就会长成成片的新克隆细胞。,2、单细胞微量板克隆技术的特点和应用,微量板细胞克隆过程中，由于每一个克隆肯定来源于同一个细胞，其培养的重复性和可靠性均十分良好。,微量板细胞克隆技术可用于建立纯细胞株、检查细胞遗传性的一致性，还可用于分离细胞变种。,微量板细胞克隆技术在评价药物、毒物对细胞生长的影响、筛选淋巴细胞杂交瘤工程、基因和细胞工程、制备单克隆抗体工程中具有重要作用。,动物细胞的种质保存技术,1、种质保存的必要性,（1）动物细胞在连续的继代培养中，容易污染和产生多种细胞混杂。,（2）细胞株在继代培养过程中常常发生变异。,（3）二倍体细胞存在寿命限制，无法进行大多的传代培养。,2、保存形式,（1）组织块,（2）细胞悬浮物,（3）细胞单层培养物,3、保存方法,4、超低温泠冻技术,3、保存方法,（1）常温法-将特定的动物细胞于20-30,下进行保存的方法。如人羊膜细胞单层于28,下可保存1个月。,人肾细胞单层于25-30,下可保存1个月以上。人二倍体细胞单层可保存二周，中间换液则可保存30天以上，,（2）低温法-将特定的动物细胞于4,下进行保存的方法。如人胚组织块于4,下可保存1430天。,（3）超低温泠冻法-将特定的动物细胞于-70,以,下、或者在液氮中进行保存的方法。超低温泠冻法可以长期保存动物细胞，如二倍体细胞2BS自1973年来保存至今，其遗传性仍然没有变化。,4、超低温泠冻技术,（1）,防冻剂,准备,（2）,超低温泠冻的具体方法,（3）,超低温泠冻后的解冻方法,（1）防冻剂准备,超低温泠冻法需要使用防冻剂，以减少细胞在冻结过程中所受到的损伤。常用的防冻保护剂有：甘油、DMSO。,A、甘油-毒性较小，能够结合水，减少组织结冰量，防止细胞内盐浓度升高，具有保护细胞的作用。其使用浓度一般为520%。,B、DMSO-是目前应用较多的一种保护剂，使用浓度为5-12.5%，与甘油相比，DMSO的毒性更低、抗冻能力更强。,（2）超低温泠冻的具体方法,先配制8-10%的DMSO+15-20%的小牛血清+适量NaHCO3的保护液,将细胞培养物消化、分散、离心，收集单细胞按5*10,6,个/ml的浓度添加保护液，1ml/支分装于安瓿瓶中0-4放置2-4小时,-20放置2-4小时,-70,2-4小时,在液氮中进行保存,（3）,超低温泠冻后的解冻方法,将安瓿瓶取出，包裹4层纱布浸入40水中，振摇融化40秒混匀后立即接种到1-2瓶100ml的培养瓶中按1-2-4-8ml的方式依次加入生长液。最终加至20ml。,注意事项,A、保护液中含DMSO时，可直接用来接种。,B、保护液含甘油时，应该离心除去甘油以防影响细胞增殖。,动物细胞融合技术,动物细胞融合技术,-也称动物体细胞杂交技术，是指二个或者二个以上的动物细胞在外力作用下，合并为一个多核细胞的过程。,细胞膜蛋白质重新分布是细胞融合的基础。,（一）,促融因素,（二）,细胞之间的融合,（三）,融合后杂种细胞的筛选技术,动物细胞融合,（一）促融因素,1、,病毒诱导融合,2、,PEG诱导融合,3、,电场诱导融合,4、其它诱导融合,（1）聚乙烯醇,（2）离心力,1、病毒诱导融合,某些不同种属的动物细胞在特定病毒、病毒外壳或者病毒碎片的作用下，可以发生融合作用。如仙台病毒、流感病毒、新城疫鸡瘟病毒、疱疹病毒等。,当二种不同的动物细胞混合物中存在大量病毒时，病毒或其组分会在细胞间起粘连作用而使细胞聚集成团，细胞膜上的蛋白质和脂质双分子层产生重排、进而结合成一个整体。,病毒所诱导的融合是随机的，无法人为控制，同时融合率较低。,2、PEG诱导融合,当二种不同的动物细胞混合物中存在PEG时，就会产生细胞聚集作用。在除去PEG的过程中，即产生细胞融合现象。,所用的PEG分子量在1000-6000之间，一般浓度为40-50%，在37,下作用2-3分钟，其促融效果最佳。,PEG促融合的作用机理不清，其促融作用也具有随机性，无法人为控制。,聚乙二醇,(,PEG)法,二种原生质体等量混合之后，加入聚乙二醇（PEG）进行融合。所使用的PEG分子量要求为1000-12000。再加入Ca、Mg。,最终浓度要求：PEG-30-40%MgCl2-20mmolCaCl2-50mmolPH=9.0,为了提高融合频度，同时可采用电诱导融合法、紫外线照射融合法。,聚乙二醇法的步骤图示,融合液：含山梨醇或甘露醇，,Ca,2,，,K,。,诱导液：融合液,20,45,PEG,稀释液：含葡萄糖，,NaOH,，,甘氨酸等。,3、,电融合法,原理：,在直流电脉冲的诱导下，原生质体质膜表面电荷发生改变，从而使原生质体粘合并发生质膜瞬间破裂，进而连接闭合形成融合体。,电场诱导融合,将二种细胞混合物经过10-100V/cm的低强度非均匀交变电场作用时，细胞之间就会发生紧密接触，形成稳定的串珠状偶极子排列。在此基础上再对细胞实施瞬间高强度电脉冲就会发生膜击穿，不同细胞间通过膜脂质分子重排就能实现融合，形成一个双核或者多核的细胞。,一般来说，击穿电压为0.5-10KV/cm，作用时间为30-50微秒。,电场诱导融合不损伤细胞，具有可人为操作的控制的特性，融合率较高。,电融合仪,（二）完整细胞之间的融合,取一定数量（10,7,-10,8,个/ml）的二种亲本细胞，充分混合,离心，取下层细胞悬液0.1ml逐滴加入0.4ml、,37,、40%的PEG溶液，,37,静置90秒缓慢加入5-10ml无血清培养液，摇晃4-5次，离心，除去上清液每0.1ml细胞悬液加入25ml完全培养基，以每孔0.1ml分装于96孔培养板上。,37,下CO2培养箱中培养。,动物细胞融合,动物细胞的融合还常常用到灭活的病毒作为诱导剂,（三）融合后杂种细胞的筛选技术,筛选杂种细胞的目的是为了获得性能优良的杂合细胞。,1、,杂种细胞的筛选原理,2、,筛选系统,1、杂种细胞的筛选原理,将融合后的细胞混合物于选择性培养基上培养，终止那些同型多核、异型多核细胞以及未能发生融合的亲本细胞的生长繁殖，而仅仅允许,异型双核细胞,繁殖。,（1）同型多核融合细胞-无法合成DNA，而失去繁殖能力。,（2）异型多核融合细胞-细胞核不能进行再次分裂，也失去繁殖能力。,2、筛选系统,（1）,HAT选择系统,（2）,抗药性选择系统,（3）,营养互补选择系统,（4）原位杂交法（略）,（5）基因探针选择法（略）,（1）,HAT选择系统,正常的动物细胞，其DNA的合成途径有二条：,全合成途径,-利用外源性营养物合成DNA。这一途径能被氨基喋呤所阻断。,补救合成途径,-利用游离嘌呤和嘧啶来合成。,HAT是含有次黄嘌呤（H）+氨基喋呤（A）+胸腺嘧啶核苷（T）的一种选择性培养基。,A、,骨髓瘤细胞,-骨髓瘤细胞能够在体外长期分裂繁殖，但是其DNA合成存在着缺陷。当培养基中含有氨基喋呤（A）时，骨髓瘤细胞就无法正常生长。,HPRT,-,型骨髓瘤细胞,-属于次黄嘌呤鸟嘌呤核苷酸转移酶缺陷型细胞，其嘌呤只能通过全合成途径进行合成。,TK,-,型骨髓瘤细胞,-属于胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型细胞，其嘧啶只能通过全合成途径进行合成。,B、,淋巴细胞,-同时含有合成DNA的二条途径，但是不能够在体外长期分裂繁殖。在人工培养基中的存活时间只有1-2天。,C、骨髓瘤细胞+淋巴细胞=杂交瘤细胞-既能够在体外长期分裂繁殖，又能够通过二条途径合成DNA,因此在带有选择性的HAT培养基中，只有杂交瘤细胞才能正常存活。,（2）抗药性选择系统,利用生物细胞对于药物敏感性的差异程度，来筛选杂种细胞的方法，称为抗药性选择系统。,一种亲本细胞M对药物A敏感、同时对药物B不敏感。,另一种亲本细胞N对药物A不敏感、而对药物B敏感。,M+N融合后的杂合细胞P同时对药物A、B均不敏感。,那么，在同时含有药物A、药物B的选择性培养基中,（A）亲本细胞M不能生长（B）亲本细胞N也不能生长（C）只有杂合细胞P才能在选择性培养基中存活。,这样，经过反复分离和继代移植，就可以筛选出杂种细胞。,（3）营养互补选择系统,生物细胞在缺乏某种营养成份时就不能生长，这种细胞称为营养缺陷型细胞。,A亲本细胞为色氨酸缺陷型。,B亲本细胞为苏氨酸缺陷型。,A+B融合后的杂合细胞C则为非缺陷型。,在同时不含色氨酸+苏氨酸的选择性培养基中。,A、B亲本细胞均不能正常生长,而只有A+B融合后的杂合细胞C才能存活,动物细胞大规模生产技术,动物细胞大规模培养技术是指在人工条件下，,在,细胞生物反应器,（bioreactor）中，,进行大量培养有用的动物细胞，生产药品的技术。,20,世纪,60-70,年代，就已创立了可用于大规模培养动物细胞的微载体培养系统和中空纤维细胞培养技术。,是目前生物高科技药物大规模生产的,核心技术,（一）,培养材料,（二）,培养基,（三）,培养方法,（四）,动物细胞生物反应器,（五）,操作方式,（六）,动物细胞培养国内外生产现状,（一）动物细胞大规模培养材料,传代细胞系,工程细胞系：采用细胞融合或基因工程技术构建的细胞系,（二）培养基,1、含小牛血清的培养基-在培养基中添加5-10%的小牛血清。,2、不含小牛血清的培养基-具体有三种类型（1）基本合成培养基（2）基本合成培养基+生长因子（3）基本合成培养基+组织抽提物,起血清作用的各类生长因子-铁传递蛋白、乙醇胺、胰岛素、促胃酸激素、维生素C、可的松、硒等等成份。,（二）培养方法,1、,细胞悬浮培养法,：,CHO细胞(中华仓鼠卵巢)、BHK-21细胞(仓鼠肾)，杂交瘤细胞，昆虫细胞等进行悬浮培养,2,、,滚瓶培养法,3、,微载体培养法,：,(,贴壁-悬浮培养,),4、,固定化培养法,：,人二倍体细胞、传代细胞Vero细胞(非洲绿猴肾)等利用载体进行贴壁培养,1、细胞悬浮培养法,（1）细胞悬浮培养法的,概念,（2）细胞悬浮培养法的,工艺流程,（3）细胞悬浮培养法的,注意事项,（1）细胞悬浮培养法的概念,是,细胞在培养液中呈现悬浮生长繁殖的方法称为细胞悬浮培养法,，是细菌发酵基础上改进的,主要用于非贴壁依赖型细胞培养，如杂交瘤细胞等,也适用于兼性贴壁细胞,气升式，搅拌式反应器,细胞悬浮培养法的操作方式有3种：分批法、半连续法、连续法。,细胞悬浮培养法适用于培养确立细胞株、杂交瘤细胞、肿瘤细胞、血液细胞和淋巴细胞。可用来大量生产疫苗、a-干扰素、白介素、淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体（McAb）。,（2）细胞悬浮培养法的工艺流程,由配料罐,培养液贮罐平衡罐前培养罐主培养罐培养液分离槽离心提取干燥设备所组成。,在配料罐内配制培养液，,经过无菌过滤之后，送入培养液贮罐送入平衡罐，调整氧化还原电位至70-100Mv，以提高细胞生长繁殖速度送入前培养罐进行细胞增殖培养，再送入主培养罐生产和合成药物培养后的细胞悬液送入收集罐和分离槽离心提取干燥设备,（3）细胞悬浮培养法的注意事项,A、在培养过程中，为了保证细胞处于单颗粒均匀悬浮状态，需要采用搅拌式反应器或者气升式反应器，以较低的搅拌速度，并以一定速度通入含水量5%CO2的无菌空气，来保证细胞处于悬浮状态，并维持培养液中一定的溶解氧。,B、为了使细胞不至于产生凝聚、成团或者沉淀，在培养基的基础盐溶液中不加Ca和Mg。同时间歇式或者连续地更换部份培养液。,C、在进行动物细胞培养过程中，随时检测和控制培养过程的温度、压力、溶解氧、CO2、PH值、氧化还原电位、搅拌速度、通气量、营养成份。,D、细胞密度：,在动物组织中的细胞密度为10,9,个/ml，为自然界中的最高密度状态。,体外悬浮细胞培养状态，细胞密度一般控制在5*10,6,个/ml。,在新颖的灌流培养系统中，细胞密度可达到10,7,个/ml。,4、固定化培养法,（1）固定化培养法的,定义,（2）动物细胞的固定化培养,方法,（3）目前已经开发的固定化培养,装置,（4）,中空纤维培养器,（1）固定化培养法的定义,又称大载体培养，指采用高分子材料将细胞限制或者定位于特定的空间位置，制成固定化颗粒，进而在培养液中培养的技术称为,细胞固定化培养法,。,固定化培养有优点有：A、细胞可维持在较小体积的培养液中生长。B、对细胞抗剪切力和污染力强。C、易于更换培养液。D、细胞和培养液容易分离，分离纯化简单。E、细胞生长密度高，培养液中产物浓度高。,（2）动物细胞的固定化培养方法,吸附法,-所用载体有陶瓷颗粒、玻璃珠、硅胶颗粒、中空纤维膜、中空纤维培养器。,包埋法,-将细胞包埋于海藻酸钠、海藻酸钙、琼脂、琼脂糖、胶原、血纤维等,海绵状,基质之中。,微囊法,-将细胞好的细胞，再用长链氨基酸聚合物包被形成,半通透性,外被膜。,（3）目前已经开发的固定化培养装置,1、多层平板式反应器,2、多层园盘式反应器,3、螺旋转膜式反应器,4、多层托盘式反应器,5、卷带式反应器,6、中空纤维筒式反应器（下面以此作为主要讲解内容）,7、流化床式反应器,8、微载体搅拌式悬浮培养反应器,9、笼式通气搅拌反应器,10、贴壁培养反应器,11、蜂窝状反应器,培养筒内由数千根中空纤维所组成，封存在特制的圆筒里。圆筒内形成,2,个空间：每根纤维的管内为“内室”，灌流无血清培养液供细胞生长,管与管之间的间隙为“外室”。,接种的细胞贴附“外室”管壁上，并吸取从“内室”渗透出来的养分生长繁殖。,培养液中的血清也输入到,外室,，由于血清和细胞分泌产物如单抗的分子质量大而无法穿透到,内室,去，只能留在,外室,并且不断被浓缩。,（4）中空纤维培养器,当需要收集这些产物时，只要把管与管之间的“外室”总出口打开，产物就能流出来。细胞生长繁殖过程中的代谢废物，因为都属小分子物质，可以从管壁渗进“内室”,最后从“内室”总出口排出,不会对“外室”细胞产生毒害作用。,一般细胞在接种,1,3,周后，就可以完全充满管壁的空隙。细胞厚度最终可达,10,层之多。细胞停止增殖后，仍可以维持其高水平代谢和分泌功能，长达几个星期甚至几个月,。,中空纤维培养法,模拟体内的,三维培养状态,，细胞接种在中空纤维的外腔，利用中空纤维模拟人工毛细血管供给营养，使细胞高密度生长,材料有硅胶，聚砜，聚丙烯等，为,半透膜,优点,细胞生长密度高，可达10,8,个/ml以上。,细胞处于接近生理状态的理化梯度之中。,营养物质可以有效地分布，代谢产物能够及时排出。,细胞培养可达数月，易于实现连续培养。,细胞分泌的蛋白质浓度高，产品纯度可高达60-90%。,反应器体积较小。,可培养多种细胞，有利于降低成本。,2、滚瓶培养,适用于贴壁依赖型细胞和兼性贴壁细胞。,放大容易，也能实现灌流培养。,操作繁琐，传代或放大时需要用蛋白酶将细胞从瓶壁上消化下来。,2、,微载体培养法,（1）定义-,将细胞吸附于微载体表面，再在培养液中进行悬浮培养，使细胞在微载体表面生长成单层的方法称为微载体培养法。,（2）微载体培养法的优点:,兼有贴壁培养和悬浮细胞培养的双重特点。,在不增加培养罐体积的条件下就能增加动物细胞产量。,60-250um的颗粒，,创造大面积供细胞贴附生长,载体体积小，比重轻，在,轻度搅拌下即可携带细胞悬浮于培养基,20世纪80年代正式用于工业化生产各种疫苗和细胞产品,（3）微载体培养法所用的材料,对细胞无毒；容易使细胞产生贴附；其密度大于1；溶胀后微粒的直径为200-300um，可容纳几百个细胞；耐高温；非刚性，避免相互碰撞对细胞损伤；不吸附培养基中营养成分；多次使用。,目前已经选用的材料有：DEAE-Sephadex-A50DEAE-Sephadex-A52QAE-Sephadex 经处理的塑料 尼龙二甲基氨基丙基聚丙烯酰胺 聚苯乙烯,市场上出售的商品微粒有：DEAE-交联葡聚糖（Cytodex-1，Superbeads）二甲基氨基丙基聚丙烯酰胺（Biocarrier）聚苯乙烯（Biosilon）,商业化微载体,商品名 基质 带电基和 形状 直径大小 比表面积 密度 透明性,交换当量 meq/g /um /(cm,3,.g,-1,)(g.ml,-1,),Cytodex1 葡聚糖 DEAE1.5 球状 131210 6000 1.03 +,Superbeads 葡聚糖 DEAE2.0 球状 136205 5000 6000 ND +,Biocarrier 聚丙烯酰胺 二甲胺丙基1.4 球状 120180 5000 1.04 +,Cytodex2 葡聚糖 三甲基-2-羟氨基丙基 球状 114198 5500 1.04 +,Cytodex3 葡聚糖 60ug胶原/cm,2,球状 133215 4500 1.04 +,Ventragel 交联明胶 明胶 球状 150250 ND ND +,Celibeads 交联明胶 明胶 球状 115235 33004300 1.03 1.04+,Biosilon 聚苯乙烯 负电荷 球状 160300 225 1.05 Cytosperes 聚苯乙烯 负电荷 球状 160300 250 1.04 ,DE-53 纤维素 DEAE2.0 柱状 4050 ND ND -,（4）Cytodex-1微载体培养法的技术指标,干颗粒直径60-87um、在培养液中可膨胀成160-230um，每克微粒的表面积为0.6平方米，相当于7个标准转瓶（直径285mm*长度110mm）、采用培养罐进行培养。,Cytodex-1的浓度为1mg/ml。相当于8000-9000粒/ml。其表面积为10cm,2,。细胞生长密度可达10,5,个/ml。,培养前24小时，将细胞贴附于载体上。培养液、葡萄糖、细胞同时加入培养罐中。,温度为37,PH=7.2-7.3,溶解氧为20%,搅拌速度为60-75转/分钟。,（三）动物细胞生物反应器,实验室规模：小于,20L,的反应器，培养工艺研究,中试规模：,20-100L,的反应器，提供一定量的产品，共纯化、临床前的各种检测和临床观察，工艺优化实验等的需要,生产规模：大于,100L,，,1000L,居多，最大达,8000L,，用于生产，提供产品,84,搅拌式生物反应器,最经典,、最早用于动物细胞培养的反应器,通气好，搅拌剪切力小，有利于长时间，高密度培养,主要,用于悬浮细胞,的培养、微载体培养、微囊培养以及结团培养,最早于,1984,年由英国科学家,Spier,发明。,该装置的主要特点是可以避免在向培养基中通气时气泡直接损伤细胞。,同时在采用微载体系统培养时，微载体不会被由于通气所产生的泡沫滞留在气液界面中。,NBS,则在该研究成果的基础上做了进一步的改进，并于,1987,年前后将其作为商品推向国际市场,笼式通气搅拌器的改进-NBS装置,作为对最初设计的笼式通气搅拌器的改进，,NBS,装置中分别包括笼式的通气腔和消泡腔。,气液交换在由,200,目不锈钢丝网制成的通气腔内实现；而在鼓泡通气过程中所产生的泡沫经管道进入液面上部的由,200,目不锈钢丝网制成的笼式消泡腔内，泡沫经钢丝网破碎分成气、液两部分，达到深层通气而不产生泡沫的目的。,气升式生物反应器,没有搅拌，气体通过喷管进入,剪切力更小,主要用于悬浮细胞的分批式培养，近年开发用于贴壁细胞的微载体培养，并进行半连续、连续和灌流式培养,气升式细胞培养反应器不仅在植物细胞培养中应用广泛,而且在动物细胞培养中也取得了很大的成功。,和搅拌式生物反应器相比，气升式反应器中产生的湍动温和而均匀，剪切力相当小；同时反应器内无机械运动部件，因而细胞损伤率比较低；反应器通过直接喷射空气供氧，氧传递速率高；反应器内液体循环量大，细胞和营养成分能均匀分布于培养基中。,3.固定床或流化床式生物反应器,反应器内装不锈钢、玻璃珠、玻璃环、光面陶瓷、塑料或有孔的陶瓷、玻璃、聚氨酯塑料等载体,Verax,公司推出的,CF-IMMO,培养系统（右图）,专用于比重较大的多孔微球的培养,4.膜式生物反应器,培养分为两室或三室，培养基与细胞,用滤膜,分开,既可用于贴壁细胞培养也可培养悬浮细胞,优点：可使细胞达到很高密度；可随意组合进行操作，,达到保留和浓缩产品或及时分离提纯产品的目的,（四）动物细胞大规模培养的操作方式,分批操作,(batch),半连续式操作,(semi-continuous),连续式操作,(continuous),：除个别情况下用于悬浮细胞的培养生产外，一般用灌流培养来代替。,灌流式操作,(perfusion),（五）、动物细胞培养国内外生产现状,上个世纪,80,年代，培养细胞密度最大达到,2,10,6,/ml,，生产期,7,天，特异产物量为,50mg/L,。,2004,年，细胞密度最大可达到,10,10,6,/ml,，有效表达时间达到,3,周，表达量接近,5g/L,，是,1980,的,100,倍,现在世界上最大的细胞发酵罐达到,2,万升。,哺乳动物细胞生产体系还需要解决的其他问题包括无血清培养基、延迟细胞凋亡和糖基化改进等,生产能力不足,已经成为细胞表达的重组药物发展的瓶颈。以,Enbrel,为例，在,1998,年上市,6,个月内仅美国销售就超过对全球整年需求的预计，生产规模缺口很大。,又如，,HIV,蛋白微球（,microbicides,）在局部使用可以防止,HIV,传播，但至今未进入临床研究，原因也是生产量不够。,还有很多药物不仅发展中国家用不上，即便是发达国家也难以使用，估计有,80%,的血友病患者无药可用，主要是生产能力不足。,生产能力不足也导致其价格不菲,。,国外占,主流优势的是搅拌式生物反应器悬浮培养,，为提高细胞的产率，可采用流加或灌注培养及微载体培养等相关技术,Genentech,公司使用,CHO,细胞以,12,000L,搅拌式生物反应器培养槽生产,t-PA,重组蛋白以及治疗癌症的生物药物。,Gibco,公司建立的流加悬浮培养,CHO,表达,-Gal,系统，采用化学修饰的无蛋白,CHO,细胞培养基并增加,TCA,循环，生物反应器中活细胞密度最高可达,10,7,/ml,。,我国动物细胞工程制药的目标,(1),建立动物细胞,大规模培养的技术平台,。该平台是基因工程药物、单克隆抗体及疫苗等产品的关键，由以下几个要素构成：,1),高效的真核细胞表达系统,。,CHO,表达的外源蛋白最接近天然构象，是最为想的表达系统，但存在表达量低、大规模培养困难、生产成本高昂等问题。对细胞本身的生理特征进行改造，除了要求目的蛋白的表达量高外，必须适应无血清培养基培养，具有即抗细胞衰老凋亡能力；,2),性能优越的、个性化的细胞培养基，包括低血清培养基、,无血清培养基,；,3),先进的,生物反应器设备；,四军大采用,5L,CelliGen,反应器连续灌注培养杂交瘤细胞，培养第,9,天细胞密度达到,810,6,/ml,以上,目前国内未见有万升级的生物反应器用于生产的报道,同时我国有关,商品化大规模动物细胞反应器产品还处于空白,，有待于进一步改进现有生物反应器，设计或设计新型的生物反应器。,目前，百泰药业的哺乳动物细胞培养生产线，是目前中国规模最大、设施最完备、技术最先进的大规模细胞培养技术平台,(2),减少污染风险,、提高产品质量和安全性；,(3),实行“,动物药厂,”计划，尽快实现转基因动物乳腺生物反应器的产业化；,(4),发展下游工程,，主要是转基因表达产物及产品的分离纯化，在提高产品的纯度和产量同时，降低成本。,总之，我国动物细胞工程制药目前仍处于起步阶段，还有很大差距，虽然目前可生产多种有重要价值的蛋白质生物制品，如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等，但大部分还处于实验和临床阶段。,九、动物细胞工程的实例,组织纤溶酶原激活剂（t-PA）生产工艺,1、组织纤溶酶原激活剂（t-PA）生产工艺,组织纤溶酶原激活剂是一种丝氨酸蛋白酶，属单链糖蛋白，它可使组织纤溶酶原活化成纤溶酶，而纤溶酶可水解纤维蛋白，因此组织纤溶酶原激活剂对血栓具有治疗作用。,培养基-Eagle培养基，加入青霉素100U/ml、链霉素100U/ml、10%小牛血清。,（1）工程细胞构建,（2）细胞培养,（3）t-PA抗体的制备,（4）抗t-PA的亲和吸附剂的制备,A、Sepharose 4B的活化,B、抗t-PA亲和吸附剂（,t-PA-IgG-Sepharoes-4B亲和吸附剂,）的制备,（5）t-PA的分离,（6）t-PA的精制,（1）工程菌构建,人肺组织提取总RNA,由mRNA转录成cDNA,特异性扩增t-PA基因 ,鉴定,脂质体法转染CHO细胞,工程细胞,（2）细胞培养,取5L玻璃转瓶，按每平方米表面积2.5L的比例加入,Eagle,细胞培养液。,将工程细胞按常规方法消化分散、洗涤、计数、稀释成细胞悬液。,将细胞悬浮液接种到转瓶之中，接种浓度为3*10,3,个/ml置于CO2培养箱中，37下培养、通入含5%CO2的无菌空气等到长成致密单层之后，弃去培养液，用PH=7.4、0.1mol/L的磷酸缓冲液洗涤细胞单层2-3次。换入无血清Eagle培养液继续培养每隔3-4天收获一次培养液，用于制备,t-PA。,同时向转瓶中加入新鲜培养液继续培养如此反复，可获得大量,t-PA。,（3）t-PA抗体的制备,取人t-PA、或者猪心t-PA,按每只家兔200-300ug的计量，,t-PA采用福氏完全佐剂充分乳化，注射入家兔皮下。,每隔2周再用,t-PA100ug进行加强免疫，共加强2次,取家兔血清用50%硫酸铵盐析沉淀物于0下，用生理盐水透析经过Sephadex 75柱层析得到抗,t-PA的免疫球蛋白IgG备用,（4）抗t-PA的亲和吸附剂的制备,A、Sepharose 4B的活化,B、t-PA的亲和吸附剂（,IgG-Sepharoes4B亲和吸附剂,）的制备,A、Sepharose 4B的活化,Sepharose 4B用10倍体积的蒸馏水（V/V）多次漂洗、布氏漏斗抽滤,取20克,Sepharose 4B湿凝胶放入500ml的三颈烧瓶中，加蒸馏水30ml，搅均匀后，用2mol/L的NaOH溶液调节PH=11，降温至18,在通风橱中，另取溴化氰1.5g于乳钵中，加入30-40ml蒸馏水分多次研磨溶解将溴化氰溶液倒入三颈烧瓶中，升温至20-22，同时滴加,2mol/L的NaOH溶液调节PH=11-12,等反应液PH