第4章植物细胞培养.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,第四章 植物细胞培养,第一节 悬浮培养,第二节 单细胞培养,第三节 培养细胞的次生代谢及产,物积累,第四节 植物细胞的规模培养,第四章 植物细胞培养,植物细胞培养（,plant cell culture,）：,指对植物器官或愈伤组织上分离出来的单细胞,(,或小细胞团,),进行培养，形成单细无性系或再生植物的技术。,优点,：操作简便、重复性好、群体大等。,分类,：,1.,根据规模：小规模培养、大批量培养,2.,根据培养方式：悬浮培养、平板培养、看护培养、纸桥培养法,3.,根据要求的产物：诱变的细胞培养、,生产次生产物的细胞培养,引 言,第四章 植物细胞培养,植物细胞培养需要解决的问题,（,1,）氧和二氧化碳的控制，过多氧过少氧均不利于生长；（,2,）营养物的供应；（,3,）细胞密度过高引起细胞团聚甚至分化，培养过程中细胞的分化的防止，（,4,）细胞取得中微生物的去除；,植物细胞培养的意义：,（,1,）研究细胞生理代谢过程及各种影响因子；,（,2,）用于植物品种的改良；,（,3,）用于植物次生代谢物质的生产。,细胞培养过程：,1.,择适宜的外植体；,2.,诱导疏松愈伤组织；,3.,选择适宜的培养基；,4.,悬浮培养；,5.,悬浮细胞的继代与选择；,6.,悬浮细胞的同步化；,7.,悬浮愈伤组织形成及植株再生。,第四章 植物细胞培养,第一节 悬浮培养,含义：将单个游离单细胞或小细胞团按一定密度悬浮在液体培养基中进行悬浮培养增殖的技术。由愈伤组织液体培养技术发展而来。,特点,培养基体积固定,培养过程中，细胞生长，其数目 不断发生变化，呈,S,增长。,继代的方法和最佳时期,继代方法,：,用注射器或移管吸取一定量的含单细胞和小细胞团的悬浮培养物，并移到含有新鲜培养基的培养瓶里，继续进行培养。,继代,细胞生长曲线,在整个培养过程中，细胞数目不断发生变化，呈现出明显的由慢到快，再到慢，最后增长停止的细胞周期。细胞的生长呈,S,型曲线,最佳继代时期,滞后期,对数生长期,直线生长期,缓慢期,静止期,培养时间,培养细胞数目,1,2,3,4,5,1,2,3,4,5,细胞生长各个时期的特点：,缓慢期,滞后期（延迟期）,细胞很少分裂，其长短与接种量大小和继代时原种细胞所处的生长期有关,对数生长期,细胞分裂活跃，细胞数目增加，增长,速率保持不变,直线生长期,细胞生长和发育最明显的时期,生长逐渐缓慢：培养液消耗将尽，有毒代谢物质增多，氧气减少,静止期,生长几乎处于停止状态，细胞数目增加极少，甚至开始死亡。,讨论,（,1,）,滞后期的长短主要取决于在继代时原种培养细胞所处的生长期和转入细胞数量的多少。,（,2,）加入条件培养基可以缩短滞后期。,条件培养基：曾培养过一段时间组织或细胞的培养基。,（,3,）缩短两次继代时间间隔，则可使悬浮培养的细胞一直保持对数生长期。,（,4,）如果使处在静止期的细胞悬浮液保持时间太长，则会引起细胞的大量死亡和解体。,操作注意事项：,对悬浮培养细胞继代时，进液口的孔径要小，只能通过单细胞或小细胞团，使用吸管或注射器。,继代前，培养容器静置短时间，大细胞团沉降，再吸上层悬浮液。可建立良好的细胞悬浮培养物。,连续培养,(Continuous culture):,是用一定容积的非密闭系统进行细胞培养的方法，在培养过程中不断注入新鲜培养基，而使营养物连续得到补充，细胞生长和增殖连续进行，同时有等体积的培养物排除系统。,连续培养（,Continuous culture,）,加入培养基,排出培养基及其培养物,二者体积相等,分：开放式连续培养,封闭式连续培养,开放式和封闭式区别,封闭式,：排出液中的细胞用机械方法收集后，又放入原培养基，所以其培养细胞数目不断增加。,开放式,：在注入新鲜培养基的同时，培养细胞随同培养液一起流出，培养细胞数目保持恒定。,连续培养意义：,1,、植物细胞代谢调节的研究。,2,、次生物质的大量生产。,第四章 植物细胞培养,植物细胞培养的特性,（,1,）植物细胞较微生物细胞大得多，有纤维素细胞壁。（,2,）培养过程生长速度缓慢，易受微生物污染，需用抗生素；（,3,）细胞生长的中期及对数期易凝聚为团块，不能象微生物一样均匀分散，悬浮培养较难；,第四章 植物细胞培养,（,4,）培养时需供氧。（,5,）细胞培养过程有结构与功能全能性,因而易分化。,（,6,）悬浮培养中要求有一定的细胞浓度，否则不生长（,25000-50000,个,/ML,）。,第四章 植物细胞培养,悬浮培养步骤,一、愈伤组织诱导,二、悬浮系的建立与继代培养,三、悬浮细胞的生长动态,四、悬浮培养细胞的同步化,细胞的悬浮培养,(cell suspension culture),是指将游离的植物细胞按一定的细胞密度，悬浮在液体培养基中进行培养的方法。,1,、起始悬浮液的制备,愈伤组织,液体培养基,摇床振荡,悬浮培养,质地疏松，细胞分散程度大；,质地紧密，细胞分散程度小，不适于悬浮培养,转速,30-150rpm,防细胞破裂,第四章 植物细胞培养,一、悬浮培养中起始物的建立,选择适宜的外植体：幼胚、下胚轴、子叶。,选择适宜的培养基：较高浓度；必要的附加物质。,愈伤组织的要求：松散性好，增殖快，再生性强。,第四章 植物细胞培养,悬浮培养物分散性良好，细胞团较小；均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同；细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般,2-3,天增加,1,倍。,二、悬浮系的建立与继代,第四章 植物细胞培养,四、悬浮培养细胞的同步化,细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。,方法：,分选法,梯度离心、过滤,饥饿法,N,、,P,同时饥饿处理一种海藻,50 h,，有二分之一的细胞处于,G1,期。加入,DNA,合成抑制剂，如,5-,氨基尿嘧啶。细胞不能合成,DNA,，处于,G1,和,S,期。,低温处理,-4 DNA,合成受阻，细胞趋向,G1,期,五、影响细胞悬浮培养的因素,1,、基本培养基的组成,（,1,）氮 硝酸盐是最常用的氮源。,（,2,）磷 植物细胞能以各种方式吸收磷，其浓度是细胞分裂和生长的限制因子。,（,3,）硫 硫的缺失使所有蛋白质合成自动停止。,2,、有机成分 氨基酸类、维生素类,3,、碳源 碳水化合物，二氧化碳,4,、植物激素 生长素，细胞分裂素，乙烯,5,、,PH,及渗透压，培养基成分、振荡频率,第四章 植物细胞培养,第二节 单细胞培养,单倍体细胞培养主要包括三个方面：,一为花药培养；,二为小孢子培养；,三为末受精的子房和卵细胞培养。,第四章 植物细胞培养,第二节 单细胞培养,诱发植物产生单倍体主要有四种方法：,1,、种间和属间杂交,2,、物理照射和化学诱变,3,、花药和花粉培养。可产生单倍体胚，或者先诱导单体愈伤组织,再经适当途径产生单倍体植株。,第四章 植物细胞培养,第二节 单细胞培养,单细胞培养方法：,对分离得到的单个细胞进行培养，诱导其分裂增殖，形成细胞团，再通过细胞分化形成芽、根等器官或胚状体，直到长成完整植株的技术。,细胞平板培养,看护培养,微室培养,纸桥培养法,植物单细胞培养方法：,（一）平板培养法,分散的植物细胞接种于含薄层固体培养基的培养皿内的培养过程称为平板培养法。,优点：单细胞在培养基中分布均匀，便于在显微镜下对细胞进行定点观察。,由于它具有筛选效率高、操作简便等优点，被广泛应用于细胞分裂、分化、生理生化、遗传变异、次生代谢产物合成等。,缺点：通气状况不好，排泄物质易积累造成毒害或影响组织吸收。,第四章 植物细胞培养,（二）看护培养,Muir(1953),首创此法获得烟草单细胞体系。,优点：简便易行，效果好。,缺点：不能在显微镜下追踪细胞分裂、生长过程。,指利用生长的愈伤组织所产生的物质来培养单细胞或者异种愈伤组织等的方法,第四章 植物细胞培养,三、微室培养,在人工制造的无菌小室中，将一滴悬浮细胞液培养在少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法。,优点：可对培养细胞连续进行显微观察，了解一个细胞的生长、分裂、分化等过程。,缺点：培养基少，营养和水分难以保持，,PH,变动幅度大，培养细胞仅能短期分裂。,四、纸桥培养法,将滤纸的两端浸入液体培养基中，使滤纸中间部分露出培养基表面，将所要培养的细胞放在滤纸的表面上培养。,单细胞,液体培养基,滤纸,单细胞的分离,由完整的植物器官分离单细胞,由培养组织（如愈伤组织）中分离单细胞,1,、由完整的植物器官分离单细胞,机械法,酶解法,叶片是分离单细胞的最好材料,机械法,Ball&Joshi(1965),Noggle(1967),Joshi&Ball(1968),研究者和时间：,研究材料：花生成熟叶片,第一种方法：用刀片刮叶片,具体方法,:,撕去下表皮,露出叶肉细胞,用解剖刀刮下细胞,第二种方法：叶片研碎、离心,研碎成粉,加研磨介质,过滤、离心,只有薄壁组织排列松散，细胞间结触点很少时用机械法分离叶肉细胞才能取得成功。,酶解法,Takebe,等（,1968,）最早报道：用果胶酶处理可以分离大量的叶肉细胞,加果胶酶,过滤、离心,机械法和酶解法比较,机械法,酶解法,细胞不受到酶的伤害；,不用质壁分离；,细胞产量低；,细胞易破。,细胞受到酶的伤害；,要质壁分离；,细胞产量高；,细胞不易破。,2,、由培养组织（愈伤组织）分离单细胞,材料：胡萝卜肉质根,步骤：,1,诱导产生愈伤组织,2,愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织的松散性；,由愈伤组织分离单细胞的方法：,1,、将未分化、易散碎的愈伤组织转到有液体培养基的三角瓶中进行振荡培养，获得悬浮细胞液。,2,、用孔径为,200um,的无菌网过滤，,4000RPM/M,离心，除去比单细胞小的碎片，获得纯净的细胞悬浮液。,3,、用,60-100UM,的网过滤，再用,20-30UM,的网过滤，离心除去细胞碎片。,4,、回收获得的单细胞，并用液体培养基洗衣净，可用于培养。,单倍体的应用价值：,1,、在植物育种中使后代迅速纯合、提高选择效率,3,、排除杂种优势对后代的影响、,4,、遗传研究的良好实验材料体系，消除致死原因,5,、突变体的筛选，选育新型自交系,6,、遗传转化的受体材料，基因表达研究的良好材料,第四章 植物细胞培养,第三节 培养细胞的次生代谢及产物积累,一、概述,植物次生代谢产物是指植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。,植物次生代谢产物种类,酚类化合物,含氮有机化合物,萜类化合物,其 它,醌类,黄酮类,简单酚类,高等萜类,低等萜类,多炔类,有机酸,胺类,生物碱,生氰苷,莨菪碱,酪醇,花青素,紫草宁,青蒿素,人参皂甙,AA,类似物,苦杏仁苷,类别 次生代谢产物 用途,黄酮 银杏黄酮，大豆黄酮 治疗心血管疾病,芦丁，槲皮素 食品添加剂和化妆品,醌 胡桃醌 抗菌，镇静,紫草宁 抗菌、抗炎、抗病毒、止血,简单酚类 香豆素 香料，抗菌消炎,萜 类,紫杉醇 抗癌,青蒿素 抗疟疾,生 物 碱,长春新碱 抗癌,奎宁 抗疟疾,酚类化合物,罂粟：吗啡、可卡因,镇痛药物,香豆素,葡萄糖,磷酸烯醇丙酮酸,丙酮酸,乙酰辅酶,A,甲戊二羟酸,活性异戊二烯,蒽醌,甾类化合物,萜类化合物,甲瓦龙酸途径,三羧酸循环,有机酸,脂肪族氨基酸,生物碱,多酮途径,脂肪酸、环状化合物,磷酸戊酸途径,4-,磷酸赤藓糖,糖酵解,莽草酸,莽草酸途径,芳香族氨基酸,黄酮,生物碱,第四章 植物细胞培养,2.,植物次生代谢产物在医药、食品、轻化工业等领域具有重要意义。,李时珍（,1593,）在,本草纲目,中所开列的,1892,种药物绝大多数是植物药物，其药物的有效成分均为次生产物。,许多植物次生代谢产物是优良的食品添加剂和名贵化妆品原料，可以用于杀虫、杀菌，而对环境和人畜无害，是理想的环保产品。,第四章 植物细胞培养,3,规模化细胞培养是生产植物次生产物的理想途径,保护生态环境,提高生产效率,发展新型生物技术产业,来自于植物体和细胞培养的紫草宁含量比较,生产方式,生产周期,紫草宁含量（干重）,完整植株,2-3,年,1-2,植物细胞培养,3,周,14,第四章 植物细胞培养,次生代谢产物的工业化生产,20,世纪,40,年代后期，,J.Bonner,首次报道银胶菊植物组织可获得橡胶。,20,世纪,80,年代以来，细胞大规模培养生产有用的物质，如药物、食品、调料、香精、颜料等再生资源。,第四章 植物细胞培养,植物次生代谢产品的市场潜能,产品成分,用途,年销售额（亿美元）,长春花碱,治疗白血病,18-20,（美国）,阿吗灵,循环系统障碍药,5-25,（全世界）,奎宁,治疗疟疾,5-10,（美国）,致热素,杀虫剂,20,（全世界）,毛地黄,心脏病药,20-55,（全世界）,紫杉醇：二萜类化合物,最早由太平洋红豆杉,Taxus,brevifolia,的树皮中分离,广泛用于治疗卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等十几种癌症,目前主要来源于红豆杉属植物,紫杉醇简介,理化性质,英文名：,Paclitaxel,Taxol,or TM,分子式：,C,47,H,51,NO,4,水溶性：,0.7mg,ml,稳定性：,pH4,8,稳定；,pH 8,易分解；,在特定条件下紫杉醇可被氧化，但极难还原；,紫杉醇研发过程,年 代,进 展,1958,NCI,开始大规模植物药研发筛选,1967,发现紫杉醇抗癌活性,1968,从红豆杉中分离出紫杉醇,1971,完成结构鉴定,1979,发表作用机制,1983,临床,试验,1985,临床,II,期,1991,临床,III,期,1992,FDA,批准上市,NCI,称其为过去,15,年中开发的最好的抗癌药物,20,世纪,90,年代抗肿瘤药的三大成就之一,汤姆森科技桂冠奖,Ramesh Panchagnula,International Journal of Pharmaceutics.1998(172)1-15.,市场需求,抗癌一线用药,销售额,年增长率,5,亿美元,理论需求量,2g/,人,500,万人,/,年,1000kg/,年,实际销量,350 kg/,年,紫杉醇供需相差十分悬殊,图,1,：国际紫杉醇原料药需求走势图（单位：公斤）,图,2,：国际紫杉醇销售额（亿美元）,紫杉醇开发的关键问题,上游产业,药源问题,下游制剂产业,药效（活性、水溶性）,安全性,生物相容性,药源问题,红豆杉,主要原料植物,国家一级保护野生植物，全球十大濒危物种 之一,生长缓慢 分布有限,Taxol,含量低,树皮中,Taxol,含量,:0.00001-0.069%,3000,棵树,=10,吨树皮,=1kg Taxol=500,病人,人工栽培,寻找红豆衫的替代物,优点：生长周期缩短,简便、直接,缺点：,1,、紫杉醇含量低,生长缓慢,2,、提取工艺复杂,药源问题解决办法（一）,药源问题解决办法（二）,化学合成,全合成,1994,年获得成功,现有六种途径,半合成,以,10-DAB,和,Baccatin,作为半合成原料获得紫杉醇,新方法用,10-DAT,缺点：,1,、合成过程烦琐复杂，几十步,2,、费用高，化学试剂昂贵,3,、总收率太低（,2%,）,优点：,1,、原料枝叶含量丰富、提取相,对容易，充分利用再生资源,2,、产率高,3,、最具实用价值可以工业化生产,4,、获取紫杉醇构效关系信息，进行结构改造,缺点：合成过程相对复杂,（,11,步化学转化和,7,步分离）,药源问题解决办法（三）,生物方法,组织和细胞培养,微生物发酵,生物合成,研究阶段,红豆杉生物合成途径基本明确,10,种相关酶基因被克隆表达,利用基因工程手段改造红豆杉提高紫杉醇产量,优点：,1,、摆脱自然因素，可长期稳定,生长,2,、适应市场、方便调节,3,、成分简单，有利于分离纯化,4,、成本低、生长周期短,5,、为半合成提供原料,6,、有望工业化生产,缺点：,1,、产量低、不稳定,2,、工业化放大研究,红景天是景天科,(Crassulaceae),红景天属,(,Rhodiola,L.),植物，为多年生草本或亚灌木，常具肉质匍匐根状茎。我国对红景天的应用已有很久的历史，在,千金翼方,、,本草纲目,、,四部医典,中早有记载。,高山红景天,(,Rhodiola sachalinensis,A.Bor),又名库页红景天，为景天科红景天属（,Rhodiola,L.,）多年生草本植物，是长白山珍稀药用植物之一，具有增强记忆、改善心脑血管系统功能、增强免疫、抗疲劳、耐缺氧、抗肿瘤、降血糖、抗病毒、抗微波辐射。,以红景天为例,UTP+,葡糖糖,-1-,磷酸,UDP-,葡糖糖,+pi,尿苷转移酶,UDP-,葡糖糖,+,酪醇,红景天甙,+UDP,UDP-,葡萄糖基转移酶,红景天甙生物合成最后一步反应机制已经清楚，植物体内的尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶（,UDP-glucosyltransferase,，,UDPGT,，,UGTs,）以尿苷二磷酸葡萄糖（,UDPG,）和酪醇为底物催化合成红景天甙,表达量,技术路线,尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶,基因,生物信息学分析,基因及表达,特性分析,基因分离,功能分析,构建植物高效表达载体,转化回高山红景天,高山红景天,UDP-,葡萄糖基转移酶基因,（,UGT1,）,的分离及特性分析,高山红景天,UDP-,葡萄糖基转移酶基因,分离策略,UGT1,的全长,cDNA,序列,总,RNA,RT,高山红景天愈伤组织,3,RACE,简并引物,5,RACE,特异引物,高山红景天,UDP-,葡萄糖基转移酶基因,(,UGT1,),的克隆,3 RACE,扩增结果,5 RACE,扩增结果,cDNA,全长,扩增结果,500bp,M 1,1.5Kb,M 1,1.1kb,M 1,UGT1,（,accession number:AY547304),；全长,1598bp,，含有完整的编码框，编码,480,个氨基酸。,UGT1,基因的生物信息学分析,UGT1,基因特性分析,UGT1,基因的,Southern blot,杂交分析,2.5Kb,2.0Kb,Bam,H,Kpn,UGT1,基因的,Northern blot,杂交分析,18S,28S,C L,高山红景天,HPLC,色谱图,C,290.8,L,179.7,TC-,转基因愈伤；,L-,野生型植株叶片；,TL-,转基因植株叶片；,C-,野生型愈伤,UGT1,转化高山红景天,及基因功能分析,红景天甙,HPLC,测定,UGT1,功能分析,构建植物高效表达载体,农杆菌介导法转化高山红景天,UGT1,基因,潮霉素阳性愈伤组织的分子生物学检测,PCR,技术方案,潮霉素阳性植株的分子生物学检测,PCR,PCR-Southern,PCR-Southern,Southern,Northern,植物高效表达载体,pBSUGT,的构建,UGT1,BamH I,Kpn I,Hid,+,Bam,H,Digestion,Ligation,Bam,H+,Kpn,Digestion,Ligation,750bp,M,1,pBSROK,酶切鉴定,1.5Kb,3,M,4,2,1,5,6,7,8,1.6Kb,3,M,4,2,1,5,6,7,8,pBSUGT1,酶切与,PCR,鉴定,高山红景天抗性选择标记潮霉素,（,Hyg,）,适宜浓度的确定,Hyg0,Hyg5.0,Hyg15.0,Hyg10.0,潮霉素浓度为,5mg/L,时，外植体生长减慢，致死率达到,50.17%,；潮霉素浓度为,10mg/L,时，致死率高达,93.0%,；潮霉素浓度为,15mg/L,时，叶片全部死亡。,UGT1,转基因抗性愈伤组织的遗传转化及筛选,D,B,C,A,UGT1,转基因高山红景天植株的获得,A,B,C,高山红景天转基因材料分子鉴定,1.6kb,M,7,19,20,RCK,PCK,1,PCR,鉴定,RCK,PCK,7,20,PCR-Southern,鉴定,高山红景天转基因愈伤组织分子鉴定,2.0kb,1.5kb,PCK,19,20,Southern,鉴定,高山红景天转基因植株分子鉴定,1.6kb,M,5,6,9,RCK,PCK,2,PCR,鉴定,PCR-Southern,鉴定,RCK,PCK,2,9,高山红景天转基因材料分子鉴定及转基因高山红景天愈伤组织红景天甙含量的,HPLC,测定,290.8,C,TC,569.2,TC,L,TL,C,TC-,转基因愈伤；,L-,野生型植株叶片；,TL-,转基因植株叶片；,C-,野生型愈伤,Northern,鉴定,第四章 植物细胞培养,高等植物提供的天然物质、性质及用途,培养植物种属,产物,组 莨菪属、蔓陀罗属,穿心莲属,细胞生长后期积累,托品类生物碱,内酯、倍半萜类,组 胡萝卜属,快速生长期积累,肉桂酸,组 长春花属,烟草属,与细胞生长平行积累,长春花碱,(,治白血病,),烟碱,(,杀虫剂,),组 紫草,稳定期积累,紫草宁,(,抗癌药,),第四章 植物细胞培养,人参工业化生产,幼茎、叶柄进行,愈伤组织培养,（固体培养）,扩大培养,（液体培养）,平板培养,（固体培养）,扩大培养,（液体培养）,大量培养,人参皂苷提取,（定量、定性分析）,建立细胞株,选择高产,细胞株,培养基：,MS+0.5mg/L 2,4-D,温度：,25,、黑暗条件,酶处理叶肉、根尖、髓组织,愈伤组织转入增殖培养基,液体,MS+0.5mg/L 2,4-D,转速,80-90r/min,，,28,光照,在克氏瓶中加入,10mL,悬浮液,20-30,黑暗培养初步鉴定,液体培养，继代,/5,周,28,光照，,80-90r/min,多次重复鉴定,植物次生代谢产物的提取与分离纯化,1,、细胞破碎,2,、提取,3,、沉淀分离,4,、层析分离,5,、萃取分离,6,、结晶,7,、浓缩与干燥,第四章 植物细胞培养,第四节 植物细胞的规模培养,一、植物细胞规模化培养体系建立,种细胞的选择,种细胞系的增殖与放大,大规模培养体系的建立,第四章 植物细胞培养,1.,种细胞的选择,外植体选择：,植物类型、组织、器官,高产细胞的建立：,第四章 植物细胞培养,2.,种细胞系的增殖与放大培养,目的,：获得大量的活跃生长的细胞群体，为细胞大批量生产准备基础材料。,方法,：液体振荡培养，从几百毫升到几升逐级放大。,第四章 植物细胞培养,3,、植物细胞大规模培养,细胞大规模培养,半连续培养,(semi-continuous),连续培养,(continuous culture),封闭式连续培养,开放式连续培养,成批培养,（,bacth culture),第四章 植物细胞培养,半连续培养,含义,：在完成成批培养的一个周期后，只从反应器中取出大部分细胞悬液，保留小部分细胞悬液作为下一培养周期的种细胞，然后加入新鲜培养基进行培养。,特点,：可以节省种细胞培养成本，同时保留的培养液有利于细胞分裂启动。但细胞同步性不是很好。,第四章 植物细胞培养,固定化培养,细胞固定化培养,是指将游离的细胞包埋在多糖或多聚化合物制备成的网状支持物中，培养液呈流动状态进行无菌培养的一门技术。,第四章 植物细胞培养,细胞固定化培养技术按照其支持物不同可以分为两大类：,包埋式固定化培养系统,：支持物多采用琼脂、琼脂糖、藻酸盐,b,、聚丙烯酰胺等；,附着式固定化培养系统,：支持物采用尼龙网、聚氨酯泡沫、中空纤维等材料。,固定化细胞生物反应器,第四章 植物细胞培养,固定化细胞生物反应器优点,细胞固定在支持物上,，培养基不断更换，可以在培养基中提取产物，免除了培养基中因含有过多的次生产物而对细胞代谢产生的反馈机制。,可以较容易地控制培养系统的理化环境,，从而研究特定的代谢途径，便于调节,有利于次生产物的合成,由于细胞固定在一定的介质中，可以不断提取产物，即可以进行连续生产。,第四章 植物细胞培养,二、植物细胞大规模培养的技术要求：,1.,培养的细胞在遗传上应是稳定的，以得到产量恒定的产物；,2.,细胞生长及生物合成的速度快，在较短的时间内能得到较高产量的终产物；,3.,代谢产物要在细胞中积累而不被迅速分解，最好能将其释放到培养基中。,第四章 植物细胞培养,两相培养技术,两相培养技术：,是在培养体系中加入水溶性或脂溶性的有机物或者具有吸附作用的多聚化合物，使培养体系形成上、下两相，细胞在水相中生长，合成的次生代谢产物分泌出来后转移至有机相中。,两相培养技术的优点,：减少产物的反馈抑制作用，提高产物含量（促进储存在细胞内部的产物分泌）；通过有机相的不断回收及循环使用，实现培养的连续化。,第四章 植物细胞培养,建立植物细胞的两相培养系统必需满足以下条件,添加的有机物或多聚化合物对植物细胞无毒，不会影响细胞的生长和产物的合成。,产物能较容易地被有机物吸附或溶解于有机相中。,两相之间的分离容易。,有机物或多聚化合物不能吸收培养基中的有效成分。,两相培养的应用举例,紫杉醇,细胞两相培养,第四章 植物细胞培养,实验材料：采用东北红豆杉细胞系，培养基采用某些成分加倍后的,B5,培养基，附加水解酪蛋白等成分。有机溶剂采用十六烷、油酸等对产物有大的分配系数的物质。,生产过程与紫杉醇的含量分析：,结果：胞内含量：,0.893mg/L;,胞外培养液,:0.75mg/L;,有机相中,:10.65mg/L,。,第四章 植物细胞培养,三、人工种子的概念及意义,人工种子,（,artificial seed,）,是指通过植物组织培养的方法获得的具有正常发育能力的材料，如胚状体，外面再包有特定物质，通常是一层有机的薄膜包装，这种与天然种子相类似的人工合成种子称作人工种子或无性种子和人造种子。,第四章 植物细胞培养,具有繁殖速度快、结构完整等特点,体细胞胚可以固定,F1,代杂种优势。,为一些不能采用种子繁殖的园艺作物开辟了良种繁育的新途径。,（一）、人工种子意义,第四章 植物细胞培养,（二）、人工种子的制作程序,体细胞胚的诱导及同步化控制,人造胚乳及人造种皮研制及包埋,人工种子的贮存及萌发,第四章 植物细胞培养,人工种子的制作程序,高质量体细胞胚发生系统的建立,体细胞胚胎发生的同步化控制,化学抑制法、,低温抑制法、机械过筛选择法、渗透压选择法、应用植物胚性细胞分级仪,第四章 植物细胞培养,（三）、人造种皮及人造胚乳研制及包埋,人造种皮的研制,对人造种皮总的要求是：能保持胚状体的活力，利于萌发和贮藏。,因此，所选的材料要有韧性，耐压，对胚状体无毒害作用，含有胚状体发芽生长所需的营养成分或植物激素，还应含有杀菌剂以防止播种后土壤微生物的侵染。,张桂芳中草药,2011,第四章 植物细胞培养,人造种皮及人造胚乳研制及包埋,人造胚乳的研制,人造胚乳的主要成分为,无机盐、碳水化合物及蛋白质,等营养物质。,人造种子的包埋技术的研制,最佳的包埋材料是,藻酸盐,包埋方法有,滴注法,和,装模法,四、人工种子研究历史,*,1978,年,Murashige,提出,人工种子概念,*,1986,年,Redenbaugh,等成功地利用藻酸钠包埋单个体细胞胚，,生产人工种子,。,*,胡萝卜、棉花、玉米、甘蓝、莴苣、苜蓿等人工种子制作获得成功。,*在我国人工种子的研究已列入国家高新技术研究与发展计划（,863,计划），并已取得一些重要的研究成果。,五、人工种子各部分功能,1,体细胞胚,2,人工胚乳,可向人工胚乳内自由添加有利于胚状体正常萌发所需的各种营养成分、防病虫物质、植物激素等，也是人工种子优越于天然种子之处。,3,、人工种皮,六、人工种子种类,根据包裹体细胞胚材料的不同，可以将人工种子分为以下,4,种类型（,Redenbaush,等，,1991,）。,（,1,）裸露的或休眠的繁殖体，可以直接播种，如休眠微型薯等。,（,2,）人工种皮包裹的繁殖体。,（,3,）水凝胶包埋的胚状体、不定芽以及休眠的小鳞茎等繁殖体，水凝胶中可含多种养分和激素，促进繁殖体的生长。,（,4,）液胶包埋的繁殖体。,（海藻酸钙凝胶）,（云杉）,七、人工种子与天然种子比较有其自身的特点：,（,1,）可对一些自然条件下不结实的或种子很昂贵的植物进行繁殖。,（,2,）固定杂种优势，使,Fl,杂交种可多代利用，使优良的单株能快速繁殖成无性系品种，从而大大缩短育种年限。,（,3,）在人工种子的包裹材料里加入各种生长调节物质、菌肥、农药等，可人为地影响控制作物生长发育和抗性。,(4),可以保存及快速繁殖脱病毒苗，克服某些植物由于长期营养繁殖所积累的病毒病等。,(5),与试管苗相比成本低，运输方便,(,体积小,),，可直接播种和机械化操作。,*,人工种子制备包括胚状体的诱导与同步化、人工种子的包埋、人工胚乳的制作、人工种皮的制作、人工种子贮藏等步骤内容。,1,、高质量和高产量的体细胞胚诱导与同步化控制,体细胞胚的诱导与同步化控制方法：,八 人工种子的研制,体细胞胚诱导与同步化控制,苜蓿体细胞胚的生产与植株的获得,www.plant.uoguelph.ca/research/embryo/embryo.htm,2,、人工种子包埋,进行包埋时应做到以下几点：,（,1,）包埋材料必须对体细胞胚无损害和无毒性，并能保护胚和胚发芽的能力，成本低廉；,（,2,）同时在制造、贮藏、运输和种植过程中必须具有耐久性，一定的硬度；,（,3,）胶囊必须含有养分和植物激素以及植物生长和发育所需的成分和水分，以保证体细胞胚的正常萌发；,（,4,）人工种子适合于农业机械化播种。,a,成熟的体细胞胚；,b,用无菌吸管吸取与包埋剂混合的体细胞胚,c,带体细胞胚的液滴滴入,2,CaCl,2,溶液后形成的白色半透明的包埋丸；,d,人工种皮包埋制成的人工种子,人工种子的制备,3,包埋方法：,经研究认为藻酸盐所形成的胶囊是目前最好的凝胶包埋材料，所采用的主要方法是滴注和装膜两种。,（,1,）滴注法,制备人工种子是将选择好的体细胞胚悬浮于含,2%,3%,的藻酸钠溶液中，然后用一个塑料吸管吸注含体细胞胚的藻酸钠悬滴加入到,0.1mol/LCaCl,2,溶液中，这时离子间发生交换而形成胶囊，胶囊的直径依赖于吸管的内径和吸注的速度，胶囊的大小，视体细胞胚的大小和发芽能力而定，一般采用吸管口径为,3,4 mm,，可得直径为,4,5 mm,的胶囊。体细胞胚包在胶囊中的位置不宜处在中央，宜偏在一边以利萌发。至于聚合时间长短则依赖于所用试剂浓度。一般藻酸钠的浓度控制在,2,3%,，在,CaCl,2,中停留实践不要超过,10min,，以免胶囊太硬而影响发芽。形成胶囊后转入无菌水中冲洗，最后在,1/2MS,培养基上作发芽和转换试验或进一步包裹人工种皮。,滴注法,人工种子包埋过程示意图,（,2,）装膜法,制备人工种子是把体细胞胚混合到一个温度较高的胶液中，然后滴注到一个有小坑的微滴板上，随着温度降低变为凝胶而形成胶丸。,4,、人工种皮的研制,美国杜邦公司生产的,Elvax4260,是一种较好的,“,人工种皮,”,材料，是由乙烯、乙酸和丙烯酸三种物质共聚的产物，用它作为人工种子最外层的包裹剂，即人工种皮取得较好效果。,5,、用,Elvax,作为人工种皮的具体操作程序为：,（,1,）将,4 g,藻酸钙胶囊置于,20 mL,含,0.1 g,葡萄糖和 含,0.2 mL,甘油的氢氧化钠溶液中搅拌,1min,；,（,2,）在,50 mL,环乙烷中加入,10%,的,Elvax4260;,（,3,）在,40,条件下溶解,5g,硬脂酸，,10 g,鲸醋醇和,25 g,鲸醋取代物，另加,295 mL,石油醚和,155 mL,二氯甲烷；,(4),将藻酸钙胶囊放在上述的混合液中浸泡,10s,，取出后用热风吹干。如此重复,4,5,次，最后用石油醚冲洗干净，经尼龙布过虑后在空气中风干即可。,体细胞胚与人工种子,十、人工种子的储藏与萌发,人工种子储藏时间的长短和萌发率的高低对人工种子的应用至关重要。人工种子的寿命，其最理想的状态是能够与真正的合子胚种子的寿命一样长,此外，海藻酸盐胶囊本身又抑制呼吸，更加缩短了体细胞胚的寿命。因此，储藏和萌发是人工种子研制的主要难点之一。,延长人工种子储藏时间和提高其萌发率的主要方法包括低温法、干燥法、抑制法、液体石蜡法等以及这些方法的组合。,十、人工种子的储藏方法,1,、低温储藏技术,2,、液体石蜡储藏技术,3,、超低温储藏技术,4,、干燥法,李修庆等,(1990),研究胡萝卜人工种子的结果表明,:,人工种子在液体石蜡中短时间保存,(1,个月,),能较正常的生长,但时间一长,(79 d),人工种子苗的生长则明显比对照组差,;,并发现液体石蜡对幼苗的呼吸和光合作用有一定的阻碍作用。在,2,的液体石蜡中,2,个月后只有,2%,萌发。,1,、人工种子的应用目前存在的问题,（,1,）许多有价值的作物，特别是那些不易获得种子和自然增殖率极低的植物，目前尚未显示出较好的体细胞胚发生能力，或胚的生活力差；,（,2,）有些作物虽然可以诱导出体细胞胚，但胚胎发生机制研究不够，而且同步化等技术尚未解决，因而难以达到大量控制同步化的目的；,（,3,）人工种子的成本远高于自然种子；,（,4,）人工种子贮藏、运输和加工以及机械化播种，尚未完全解决，许多问题尚待进一步研究和探索。,十一、人工种子应用前景,2,、人工种子应用应该考虑哪些方面,（,1,）首先应考虑该作物的价值；,（,2,）要考虑那些很难获得种子，而且自然增殖率极低的植物。,例如：多年生名贵药材，高质量的木材和橡胶树或优质果树以及珍惜濒危植物等。,