第四章1生物信息的传递(下)从mRNA到蛋白质(4).ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,一、概述,蛋白质合成翻译：,指将,mRNA,链上的核苷酸从一个特定的起始位点开始，按三个核苷酸代表一个氨基酸的原则，依次合成一条多肽链的过程。,第一节 遗传密码,三联子,蛋白质合成的场所：核糖体,合成的模板：,mRNA,合成的原料：氨基酸,运送氨基酸的工具：,tRNA,复杂性：多种,RNA、,蛋白质、酶等生物大分子参与这一过程。如真核生物，参与蛋白质合成的有：,核糖体蛋白：70多种,氨酰-,tRNA,合成酶：20多种,起始因子、延伸因子、终止因子：10多种,tRNA：50,种左右,各种,mRNA,和,rRNA,参与蛋白质翻译后加工的酶：100多种,有高能化合物参与,共计有近300种大分子参与,各种组分约占细胞干重的35%,合成代谢能量90%消耗在蛋白质合成上。,（二）三联密码的证实,1961年Crick和Brenner.S等证实了三联密码子的真实性。,T4染色体上的r位点与侵染大肠杆菌有关。通过用原黄素（proflavin）处理，可以使DNA插入或删除单个碱基，插入叫“加字”突变，删除的叫“减字”突变，无论加字和减字都可以引起移码突变。,Crick小组用这种方法获得一系列的T4“加字”和“减字”突变，再进行杂交来获得加入或减少一个，二个，三个不同碱基数的系列突变。,开始用原黄素诱导的突变称FCO，它们只能在,B,菌株上生长形成噬菌斑,他们再用原黄素诱导产生回复突变，在,E.coli K,（）菌株中出现了噬菌斑。,用遗传学的方法和野生型杂交发现它们并不是真正的野生型。,校正突变（A suppressor mutation）抵消或抑制了前一次突变的效应。,加入或减少三个密码子，读码框不变,结论：,1.密码的阅读有方向性,2.三个碱基编码一个氨基酸,3.从固定起点阅读,（三）利用突变来解读密码,1960 A.Tsugita,H.Fraenkel-Connrat小组和H.G.Wittmann小组试图通过用亚硝酸来对TMV进行诱变。,当时根据亚硝酸诱变的原理，mRNA中的A次黄嘌呤，CU。,当时已搞清了TMV肽链的一级结构由158个氨基酸组成，,将突变型和野生型进行比较就能确定肽链上氨基酸取代的位点和类型。,结论：,密码子不重叠,。,（四）无细胞系统的建立,1961年Nirenberg建立了无细胞系统,这一新技术是在多核苷酸磷酸化酶发现的基础上建立起来的。,1955 S.Ocha在细菌中分离了多核苷酸磷酸化酶（polynucleotide phosphorylase）,它催化核糖核苷二磷酸的聚合，,它不需要任何DNA模板就可合成.,方法:,(1)去模板：用DNAase处理,E.coli,抽提物，使DNA降解，除去原有的细菌模板。,(2)加入polU：合成了多聚苯丙氨酸，,这一结果不仅证实了无细胞系统的成功，同时还表明UUU是苯丙氨酸的密码子。,分别加入polyA，polyC 和polyG 结果相应地获得了多聚赖氨酸，多聚脯氨酸和多聚甘氨酸。,(3)按比例加入种核苷混合的多聚物,Nirenberg想出了一种方法，就是按一定的碱基比例来合成RNA。,比如在底物中加5份的U和1份的G，,碱基比为U：G5：1，,它们能组成8种三联体：,UUU，UUG，UGU，GUU，,GGG，GGU，GUG，UGG。,U和G将随机地加入到三联体中，这样按比例各个位点上进入U和G的概率不同，如氨基酸测定结果：,如UUU：UGG（5,5,5）:（5,1,1）,25 ：1,同理UUU：UUG 5 ：1，,根据检测结果推测:,苯丙氨酸（UUU）：半胱氨酸（UGU）,5 ：1,苯丙氨酸（UUU）：缬氨酸（GUU）,5 ：1,苯丙氨酸（UUU）：甘氨酸（GGU）,25 ：1,（五）三联体结合实验,1964年Nirenberg又采用三联体结合实验,(1)tRNA和氨基酸及三联体的结合是特异的；,(2)上述结合的复合体大分子是不能通过硝酸纤维滤膜的微孔，而tRNA-氨基酸的复合体是可以通过的。,搞清了各种氨基酸的碱基组成，但不知其序列。,（六）利用重复共聚物破译密码,Khorara 采用了有机合成一条短的单链DNA重复顺序，,然后用DNApol合成其互补链，,再用RNApol及不同的底物合成两条重复的RNA共聚物，作为翻译的mRNA，加入到体外表达系统中翻译。,（七）终止密码子的确定,1964年Yanofsky在研究,E.coli,色氨酸合成酶A蛋白时,推测无义密码子的存在,。,为trpA编码的mRNA还编码了trpB，trpC，trpD和trpE。那么有可能在翻译时中途在某个位点（两个肽的连接处）停止，然后再从下一个新的起点翻译，这样使各个肽可以分开，而不至于产生一条很长的肽链。,他发现,E.coli,Trp,-,的突变株不能合成完整的色氨酸合成酶蛋白，那么这类的突变很可能携带有阻止合成的无义密码子。,1962年Benzer和他的学生S.Champe,发现野生型T4的,r,有两个顺反子,rA,和,rB,，共同转录一个多顺反子mRNA，但翻译成两个分开的蛋白A和B。突变型rl589，被证明是缺失所造成，缺失的区域含,rA,基因右边的大部分，和,rB,左边的小部分。rl589的产物是一条多肽，但无蛋白A的活性，但有B蛋白的活性。,Benzer认为，这种缺失可能使mRNA失去了A蛋白合成“终止”和“B”蛋白合成“起始”的密码子，因此翻译时沿着一条mRNA阅读下去，产生了一条长的肽链。,1964年Brenner及其同事获得了T4噬菌体编码头部蛋白基因的琥珀突变（amber），并进行了精细作图;,并分离研究了各种突变型的多肽。,突变型的肽链比野生型的要短，因此可以推测琥珀突变可能产生终止密码子，使肽的合成在中途停止下来；,由于突变位点越靠近基因的左端，所产生的肽链越短，越靠近右端越接近野生型，据此可以推测翻译的过程是,从mRNA的5端向3阅读,。,肽链的合成是,从N端向C端延伸,。,1965年Weigert,M.和Garen,证明,E.coli,中无义密码子的碱基组成为,UAA,和,UAG,。,最后1967年Brennr和Crick证明,UGA,是第三个,无义密码子,。,三个终止密码子:,UAA叫赭石（ochre）密码子；,UAG叫琥珀 (amber)密码子；,UGA叫蛋白石（opal）密码子。,（八）起始密码子的确定,将各种蛋白质的氨基酸顺序和其编码顺序相比较，起始时都是,AUG,密码子，在原核生物中编码甲酰甲硫氨酸，在真核生物中编码甲硫氨酸。,GUG是RNA噬菌体MS2的“A”蛋白的起始密码子。当正常的AUG起始密码子缺失时，GUG也担当起始密码子的作用。,但在离体条件下GUG的起始翻译的效率要比AUG低得多，可能因为它和甲酰甲硫氨酸-tRNA的亲和力较低，这也可以作为调控该基因表达的一种手段。,（三）遗传密码的性质,(1)遗传密码是三联体密码。,(2)遗传密码是连续的。,(3)遗传密码不重迭。,(4)密码子有起始密码子和终止密码子。,(5)遗传密码具有简并性(degeneracy)。,由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象。同义密码子。,(6)遗传密码具有通用性和特殊性,。,遗传密码在纤毛虫和线粒体中的改变,(7)反密码子中的“摆动”（,wobble）,密码子与反密码子的相互作用。,摆动假说(,wobble hypothesis,),是由,Crick（1966,年）提出的。,即当tRNA的反密码子与mRNA的密码子配对时前两对严格遵守碱基互补配对法则，但第三对碱基有一定的自由度可以“摆动”。摆动假说也称为三中读二。,第二节 tRNA,一、tRNA的结构,1.三叶草型的二级结构,(1)各种tRNA均含有70-95个碱基，其中22个碱基是恒定的。,(2),5,端和,3,端配对（常为7,bp）,形成茎区，称为受体臂（,acceptor arm）,或称氨基酸臂。在,3,端永远是4个碱基（,XCCA）,的单链区，在其末端有2,-OH,或3,-OH，,是被氨基酰化位点。此臂负责携带特异的氨基酸。,（3）,TC,常由5,bp,的茎和7,nt,的环组成。此臂负责和核糖体上的,rRNA,识别结合；,(4)反密码子臂(,anticodon arm),常由5,bp,的茎区和7,nt,的环区组成，它负责对密码子的识别与配对,。,(5)D,环,(D arm),的茎区长度常为,4bp,，也称双氢尿嘧啶环。负责和氨基酰,tRNA,聚合酶结合;,(6)额外环(extra arm)可变性大，从4nt到21nt不等，其功能是在tRNA的L型三维结构中负责连接两个区域（D环反密码子环和TC-受体臂）。,2.tRNA的L形三级结构,tRNA,的三级结构都呈,L,形折叠。这种结构是靠氢键来维持的，,tRNA,的三级结构与,AA-tRNA,合成酶的识别有关。,3,A,C,C,anticodon loop,5,T,Y,C loop,(1)氨基酸受体臂位于L型的一侧，距反密码子环约70 A,(2)D环和TC环形成了“L”的转角。,(3)在一些保守和半保守的碱基之间形成很多三级氢键,使分子形成L形,并使结构稳定。,(4)不同于,DNA，,涉及到与磷酸核糖主链相互作用的三级结构的磷酸二酯键分布在核糖的2-,OH,上。,(5)几乎所有的碱基平面之间都产生碱基堆积的作用。,转录过程信息转移靠的是碱基配对。,翻译阶段信息是以能被翻译成单个氨基酸的三联子密码形式存在的，起作用的是解码机制。,二、,tRNA,的功能,蛋白质合成,AA-tRNA,合成酶活化,AA-tRNA,生成,tRNA,上的反密码子与,mRNA,上的密码子相互识别并配对,三、tRNA的种类,（1）起始tRNA和延伸tRNA能特异地识别mRNA模板上起始密码子的tRNA叫起始tRNA，其他tRNA统称为延伸tRNA。原核生物起始tRNA携带甲酰甲硫氨酸（fMet），真核生物起始tRNA携带甲硫氨酸（Met）。,（2）同工tRNA代表同一种氨基酸的tRNA称为同工tRNA，同工tRNA既要有不同的反密码子以识别该氨基酸的各种同义密码，又要有某种结构上的共同性，能被AA-tRNA合成酶识别。,（3）校正tRNA,在蛋白质的结构基因中，一个核苷酸的改变可能使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子(UAG、UGA、UAA)，使蛋白质合成提前终止，合成无功能的或无意义的多肽，这种突变就称为无义突变。通过改变反密码子区校正无义突变的tRNA称为校正tRNA，其分为无义突变及错义突变校正。,tRNA,无义突变校正,野生型,UAG,、,UGA,、,UAA,三种无义抑制,50,UAU,UAC,A,GAUCU,Arg,Gly,GGACCU,U,CU,Gly,C,CU,Gly,tRNA,错义突变校正,Gly,突变校正是由于,tRNA,的反密码子突变导致的。,四、氨酰tRNA合成酶,是一类催化氨基酸与tRNA结合形成氨基酰tRNA的特异性酶,存在于胞液中,高度特异,对氨基酸有极高的专一性,对tRNA具有极高专一性,只作用于L-氨基酸,催化的反应,氨基酸,+tRNA,氨酰,-tRNA,ATP,AMP,PPi,氨酰,-tRNA,合成酶,Mg,2+,第一步反应,氨基酸,ATP-E,氨基酰,-AMP-E,AMP,PPi,第二步反应,氨基酰,-AMP-E,tRNA,氨基酰,-tRNA,AMP,E,蛋白质合成的忠实性取决于,AA-tRNA,合成酶正确识别相应的,tRNA,和氨基酸，使二者结合形成氨酰,tRNA,。,AA-tRNA,合成酶如何识别结构非常相似氨基酸呢？,动力学校对,（,Kinetic proofreading,）,化学校对,（,Chemical proofreading,）,氨基酰,tRNA,合成酶具有校正作用,动力学校对,I,V,B,H,ValAMP,B,H,B,H,aa-tRNA loading,B,H,V,I,Ile,分子构型大于,Val,Val,进入,B,位点并进入,H,位点而被降解,Ile,进入,B,位点但不能进入,H,位点,B,：结合位点,H,：水解位点,化学校对,氨基酰,-tRNA,的表示方法：,Ala-tRNA,Ala,Ser-tRNA,Ser,Met-tRNA,Met,第三节 核糖体(,ribosome,),1953,年,Robinson,Brown,在植物细胞中发现。,1955,年,Palade,在动物细胞中发现。,1958,年命名为核糖核蛋白体，简称核糖体。,核糖体存在于细胞质中，是一种致密的核糖核蛋白颗粒，是合成蛋白质的场所，,其功能是合成多肽链。,一个细菌细胞内约有,20000,个核糖体，而真核细胞内可达,10,6,个，在未成熟的蟾蜍卵细胞内则高达,10,12,。,核糖体既可以游离在胞质中，也可以结合到内质网上或与细胞骨架结构相关联。,细胞有两种主要的核糖体类型:,原核细胞的核糖体:沉降系数为70S，由50S和30S两个亚基组成。,真核细胞的核糖体:沉降系数是80S，由60S和40S两个亚基组成。,核糖体由大小两个亚基构成，大亚基呈半圆形，一侧伸出三个突起，中央有一凹陷。小亚基呈长条形，约于,1/3,长度处有一细的缢痕，使小亚单位分为大小两个部分。二者结合起来时，凹陷部位彼此对应，形成一隧道。在不进行蛋白质合成时，大小亚基呈游离状态，只有当小亚基和,mRNA,结合后大亚基才与小亚基结合形成完整的核糖体,一、核糖体的结构,二、,核糖体的化学组成,核糖体的本质是核糖核蛋白体。由蛋白质和核酸组成：蛋白质占,40%,，分布在核糖体表面；,rRNA,占,60%,，分布于核糖体内部。原核生物核糖体由约,2/3,的,RNA,及,1/3,的蛋白质组成。真核生物,RNA,占,3/5,，蛋白占,2/5,。,原核生物与真核生物核糖体成分的比较,各种来源的核糖体亚基组成,来 源 完整核糖体 核糖体亚基 核糖体RNAs,细胞质 80S 60S(大亚基)20-29S,5.8S,5S,(真核生物)40S(小亚基)16-18S,细胞质 70S 50S(大亚基)23S，5S,(原核生物)30S(小亚基)16S,线粒体 55S 40S(大亚基)16-17S,(脊椎动物)30S(小亚基)10-13S,大肠杆菌核糖体小亚基由,21,种蛋白质组成，分别用,S1S21,表示，大亚基由,36,种蛋白质组成，分别用,L1L36,表示。真核生物细胞核糖体大亚基含有,49,种蛋白质，小亚基含有,33,种蛋白质。核糖体上有不止一个活化中心，每个中心都由一组特殊的蛋白质构成，虽然蛋白质都有催化功能，但脱离核糖体，该功能消失。,70S,核糖体可容纳两个,tRNA,和约,40bp mRNA,。,1、核糖体结合蛋白,2,、,rRNA,5S rRNA,：,120,或,116,个核苷酸。两个高度保守的区域，一个含,CGAAC,。是,5S rRNA,与,tRNA,相互识别的序列，与,T,C,环上的,GT,CG,相互作用的部位。,另一个区域含有保守序列,GCGCCGAAU GGUAGU,与,23S rRNA,序列互补。,16S rRNA,：,与,mRNA,、位于,50S,亚基的,tRNA,的反密码子直接作用。,长度：,1457-1544,个核苷酸，压缩在,30S,小亚基内。结构十分保守。,3,端有,ACCUCCUUA,的保守序列，与,mRNA,5,端翻译起始区富含嘌呤的,SD,序列互补。,3,端有一段与,23S rRNA,互补的序列，在,30S,与,50S,亚基的结合中起作用。,23S rRNA,：,2904,个核苷酸。存在一段能与,tRNA,Met,序列互补的片段，表明核糖体大亚基,23S rRNA,可能与,tRNA,Met,的结合有关。,5,存在与,5S rRNA,互补的序列，表明在,50S,大亚基上这两种,RNA,之间可能存在相互作用。,50S,核糖体上约有,20,种蛋白质与,23S rRNA,相结合。,5.8S rRNA,：,160,个核苷酸，含有,5S rRNA,中的保守序列,CGAAC,，可能是与,tRNA,作用的识别序列。,18S rRNA,：酵母中,1789,个核苷酸，,3,端与大肠杆菌,16S rRNA,具有广泛的同源性。,28S rRNA,：约,3890-4500bp,，功能不详。,3、核糖体上的3个tRNA结合位点,核糖体的功能位点,A,、,P,、,E,位点,与新掺入的氨酰-tRNA的结合位点氨酰基位点，又称,A位点,与延伸中的肽酰-tRNA的结合位点肽酰基位点，又称,P位点,肽链转移后与即将释放的tRNA的结合位点 E位点,(exit site),三、核糖体的功能,合成蛋白质。,多个活性中心：,1,）,mRNA,结合部位,2,）,A,位,3,）,P,位,4,）肽基转移部位及形成肽键的部位（转肽酶中心）,5,）各种延伸因子的结合位点。,核糖体大小亚基的功能：,小亚基,：识别mRNA（起始部位识别、密码子与反密码子互作等）；具有决定翻译真实性的S4及S12 蛋白。,大亚基：,负责携带氨基酸和tRNA。,包括肽键形成，结合AA-tRNA和肽酰-tRNA等。大亚基上有延伸因子依赖的GTP酶活性，可为转肽提供能量。,一、氨基酸的活化,二、翻译的起始,三、肽链的延伸,四、肽链的终止,五、蛋白质前体的加工,第四节 蛋白质合成的生物学机制,原核生物蛋白质的合成,一、氨基酸的活化,氨基酸,+tRNA,氨酰,-tRNA,ATP,AMP,PPi,氨酰,-tRNA,合成酶,Met+tRNA,fMet,+ATP Met-tRNA,fMet,+AMP+PPi,N,10,-,甲酰四氢叶酸,Met-tRNA,fMet,四氢叶酸,fMet-tRNA,fMet,甲酰基转移酶,二、起始（,initiation,),可分为三步,:1,、,30 S,核糖体小亚基与,mRNA,结合,2,、与,fMet-tRNA,fMet,相结合,3,、与,50 S,大亚基结合,1,、,30 S,核糖体小亚基与起始因子,IF 1,和,IF-3,相结合，小亚基通过,16 S rRNA 3,端与,mRNA,中,AUG,上游,712,个碱基处,SD,序列的互补序列结合,mRNA,。,核糖体小亚基上,16 S rRNA 3,-,端有一段序列：,5-ACCUCCUUA-3,，可与,mRNA,中,AUG,上游保守序列,AGGAGGU,（,SD,）互补。将起始密码子,AUG,（或,GUG,，,UUG,）带到核糖体的起始位置上。,2,、复合体与,IF-2-GTP,复合物及,fMet-tRNA,fMet,结合，,fMet-tRNA,fMet,进入小亚基的,P,位，,tRNA,上的反密码子与,mRNA,上的起始密码子配对，形成中间复合体。,只有,fMet-tRNA,fMet,能与第一个,P,位点相结合,3,、上述复合物再与,50 S,大亚基结合，,GTP,水解，释放翻译起始因子。,起始因子的功能,IF-3分子量为20kD，具有解离30S与50S亚基的活性；是30S亚基与mRNA起始位点的特异结合所必需的。,IF-2,分子量为,95 kD,117kD,，促使,fMet-tRNA,fMet,选择性地结合到,30S,亚基上。,IF-1,分子量为,9.5 kD,，是起始复合体的一部分；阻止氨酰,tRNA,的进入，可能和起始复合物的稳定性有关。,问题：,为什么其它Met-tRNAs不能进入起始位点,？,是由于两种tRNA本身的差别导致的,（1）fMet-tRNA,fMet,在受体臂末端的一对碱基是CA，Met-tRNA,mMet,是GC，CA中的C可以和起始因子IF-2结合。,（2）tRNA,fMet,的反密码子环上的是A，tRNA,mMet,是烷基化腺嘌呤。,（3）tRNA,fMet,TC环端是A，tRNA,mMet,的相应位置是G。,谢谢大家,!,