基因表达调控-第三课-mRNA水平的研究9-29.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,基因,mRNA,蛋白质多肽链,基因表达,基因表达的变化可以两个水平进行分析：,mRNA,水平,和蛋白质水平,mRNA,表达变化的检测方法：,Northern blot,RT-PCR(,半定量,PCR),Real-time PCR(,定量,PCR),荧光原位杂交等、,基因芯片、高通量测序,等,mRNA,表达变化的机制的研究方法方法有：,启动子活性分析（转录水平分析）、,mRNA,转录效率分析（,Nuclear run on,）、,mRNA,稳定性检测（转录后水平）,一、,RNA,研究策略和方法,RT-PCR,Real-time PCR,，,Northern blot,RNA,酶保护实验,差异筛选，,基因芯片,（二）,RT-PCR,（半定量,PCR,）,RT-PCR,相关试剂,反转录引物,反转录引物,1,防止,RNA,的降解，保持,RNA,的完整性。,2.,避免,gDNA,的污染，用,DNase,处理。,3,为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。,4,内参的设定：主要为了用于靶,RNA,的定量。常用的内参 有,GAPDH,、,-Actin,等。其目的在于避免,RNA,定量误差、加样误差以及各,PCR,反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。,5.,稀释,cDNA,，内参循环数,20-26,。,6.,扩增产物长度,300-500 bp,。,注意事项：,（三）,Real-time PCR,实时定量,PCR,在,PCR,反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测,PCR,扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过,Ct,值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。,引物设计原则,在,NCBI,找到目的基因序列，以,CDS,区进行引物设计。,1.,最好位于编码区,5,端的,300-400bp,区域内，可以用,DNAman,Alignment,软件看看结果。,2.,引物长度一般在,17-25,碱基之间,上下游引物不能相差太大。,3.G+C,含量在,40%-60%,之间，,45-55,最佳。,4.,引物自身不能有连续,4,个碱基的互补。,5.,引物之间不能有连续,4,个碱基的互补。,6.,引物,5,端可以修饰。,7.3,端不要以,A,结尾，,3,端不可修饰，而且要避开,AT,GC rich,的区域，避开,T/C,A/G,连续结构（,2-3,个）。,8.,引物,3,端要避开密码子的第,3,位。,9.,荧光定量产物长度,80-150bp,最好，最长是,300bp.,10.,最好跨内含子。,11.,引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于,70,。,12.TM,值在,55-63,度之间。,DNA,或,RNA,的绝对定量分析，包括病原微生物或病毒含量的检测，转基因动植物转基因拷贝数的检测，,RNAi,基因失活率的检测等。,基因表达差异分析，例如比较 经过不同处理样本之间特定基因的表达差异,(,如药物处理、物理处理、化学处理等,),，特定基因在不同时相的表达差异以及,cDNA,芯片或差显结果的确证。,基因分型，例如,SNP,检测，甲基化检测等。,Real-time PCR,的应用：,B,A,Real-time PCR,RT PCR,定量,PCR,引物设计软件：,Primer bank,www.ncbi.nlm.nih.gov,将待检的,RNA,样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同,Southernblot,相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。,Northern,blot,主要用于检测样品中是否含有基因的转录产物（,mRNA,）及其含量。,（四）,Northern,blot,Northern,blot,流程图,Northern blot,优点：,northern blot,的灵敏度要好于基因芯片实验，而基因芯片优势在于,它可在一次实验中同时反映出几千个基因表达量的变化；,与定量,PCR,的高灵敏度相比，,northern blot,较高的特异性可以有效,的减少实验结果的假阳性。,缺点：,Northern blot,实验中要防止,RNA,的降解，所有实验用品都需要经,过除去,RNA,酶的过程，如高温烘烤、,DEPC,处理等。同时，,northern blot,中很多实验用品如甲醛、,EB,、,DEPC,、紫外灯等对人,体都有一定的伤害。,Northern blot,的优势在于它,可检测目的片段的大小,、,是否具有可变剪切出现,、可允许探针的部分不配对性，杂交过后的膜经过一定的处理除去探针后还可保存很长时间再次杂交使用。,（五）核糖核酸酶保护实验,（,ribonuclease protection assay,，,RPA,）,是灵敏度和特异性很高的,mRNA,定量分析方法,基本原理：,将标记的特异,RNA,探针（,32,P,或生物素）与待测的,RNA,样品液相杂交，标记的特异,RNA,探针与目的,RNA,结合，形成双链,RNA,，免受,RNA,酶的消化；而未结合的单链,RNA,经,RNA,酶,A,或,RNA,酶,T1,消化形成寡核糖核酸。,RPA,基本程序：,待测,RNA,的分离,体外转录标记,RNA,探针,待测,RNA,与探针,RNA,进行液相杂交,RNA,酶消化,不同大小杂交片段凝胶电泳分离,核糖核酸酶保护实验原理示意图,32,P,标记的探针：杂交双链进行变性,PAGE,，,用放射自显影或磷屏成像系统检测探针的信号；,生物素标记的探针：杂交双链经过变性,PAGE,后，,电转移至尼龙膜，用链霉亲和素辣根过氧化物酶,和化学发光底物与膜上,biotin,标记的探针结合，,X,射线胶片或化学发光图像分析仪检测杂交信号。,RPA,比,Northern Blot,的优势：,1.,过量的探针与目的基因的杂交在液相环境完成，反应更加完全,2.RPA,比,Northern Blot,灵敏,15-150,倍,，适合检测各种表达水平之基因,3.RPA,通量高，,同时检测多个基因,，可评价他们在同一情况下的差异表达,4.,一次,RPA,就能完成,10,多次,Northern Blot,的工作，加快研究速度,可对细胞或组织中原位表达的,mRNA,进行区域定位,标记探针特异性地与目标靶,mRNA,序列杂交，检测标记信号来确定基因在组织和细胞内表达的区位信息。,可作为定量分析的补充。,（六）原位杂交（,in situ hybridization,，,ISH,）,什么情况下选择原位杂交？,没有合适的抗体，不宜做,Western blot,检测；样本量太少或比较复杂，不宜提取,RNA,或蛋白。,原位杂交技术主要步骤：,材料处理及细胞样品的固定；,样品的制备和预处理；,探针的制备和预杂交；,探针及样品的变性；,杂交温育；,检测杂交信号，进行结果分析。,（七）差异表达基因筛选方法,表达序列标签,(expressed sequencing tag,，,EST),技术，,1991,差异显示,RT-PCR(different display reverse transcription PCR,，,DDRT-PCR),，,1992,抑制性差减杂交,(suppression subtractive hybridisation,，,SSH),，,1996,基因芯片,(gene chip or micrOarray),基因表达的系列分析,(serial analysis of gene expression,，,SAGE),，,1995,基于高通量测序的数字基因表达谱,(DGE),分析,转录抑制剂：,actinomycin D (ActD),放线菌素,D,5,6-dichloro-1D-ribofuranosyl-benzimidazole (DRB),-,amanitin(,-,Am),（八）,mRNA,稳定性分析,荧光素酶报告基因分析系统,二、,mRNA,稳定性调节的机制,AU-rich elements(AREs),:AUUUA,7-9%of cellular mRNAs,These elements are recognized by trans-acting factors,such as mRNA-binding,proteins that bind directly or indirectly to the cis-acting elements and promote the deadenylation and degradation of the mRNA.,AU-rich element RNA-binding protein 1(AUF1),tristetraprolin(TTP),KH-type splicing regulatory protein(KSRP),embryonic lethal,abnormal vision(ELAV)-like protein 1(HuR)and polyadenylate-binding protein-interacting protein 2(PAIP2),（,1,）,AU-rich sequences and mRNA binding proteins,（,2,）,Regulatory non-coding RNA,miRNAs,act by pairing to the mRNAs of protein-coding genes to direct their repression.,lncRNAs,show different mechanism of action,varying from chromatin remodeling,transcriptional responses and RNA processing.,（,3,）,Alternative polyadenylation(APA),APA,consist of two steps,cleavage and polyadenylation of RNAs,which are maturation events that cut and add an oligo(dA)tail to the 3 end of the nascent transcript.This processing protects mRNAs from degradation and increases their stability.,The specific cleavage position and the efficiency of the process depend on the interaction between,trans-acting polyadenylation factors,and,cis-elements,present in the pre-mRNAs,such as the,central sequence motif,AAUAAA,.,Most,mRNA regulatory elements,are situated within the 5 and 3untranslated regions(UTRs).,The mRNA stability,is regulated by the complex interplay,of,cis,-acting equences within the 3UTR of the mRNA,and,trans,-acting factors,such as RNA binding proteins(RBPs)and regulatory RNAs(microRNA and long non coding RNA that bind directly or indirectly to the,cis,acting elements and promote the deadenylation and degradation of the mRNA.,