江南大学《食品酶学》课件1-4章.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第一章 引言,第一节 食品酶学课程的历史和现状,为什么要在食品科学学科中设置食品酶学这门课程,自上世纪80年代起一系列的高新技术被应用在食品加工和保藏，促进了食品工艺的发展。,生物技术 biotechnique,微胶囊技术 microencapsulation,膜分离技术 membrane separation,分子蒸馏技术 molecular distillation,超临界流体提取技术 supercritical fluid extraction,超高温瞬时杀菌技术 ultra temperature instant sterilization,高压杀菌技术 high pressure sterilization,脉冲杀菌技术 pulse sterilization,欧姆杀菌技术,electric resistance sterilization,无菌包装技术 aseptic package,微波技术 microwave technique,复合包装技术 complex package materials,冷冻干燥技术 freeze dry technique,可食用膜技术 edible film technique,气调保藏技术 controlled atmosphere storagew,其他 others technique,高果糖 玉米糖浆,酶在分析中的应用,寡肽、低聚糖的制造,土豆保藏中酶作用对土豆加工性能的影响,天然风味料的加工,食品材料在低温保藏中控制酶活力的重要性,澄清果汁的加工,蛋白质的酶法改性,啤酒稳定性的提高,提高从天然资源中提取某种组分时的提取率,与硕士和博士研究生学位论文研究工作的关系,以生物材料作为加工或研究对象的食品学科，酶学的原理（知识）已是期望成为食品科学家的学生必须掌握并会运用的基本原理。,二、,本课程的历史，国内外概况,上世纪50年代末或60年代初，食品学科在其他学科发展和食品工业本身发展的需要之下加快了发展的步伐，上升到一个新的阶段，或者说人们更注意,Why to do,而不是,How to do,，一些新的课程相继开出，UCD食品科技系J.Whitaker首先在60年代开出高水准的食品酶学课程，,1972,年出版了教科书Principles of Enzymology For the Food Science,国内无锡轻工业学院在1984年首先开出食品酶学，,1990,年第一本食品酶学教材出版。,主要参考材料,Principles of Enzymology For the Food Science,John R.Whitaker 第一版 1972 第二版 1994,Fundamentals of Enzymology,Nicholas C.Price 第二版 1989,Enzymes in Food Processing,Tilak Nagoda Withana，Gerala Reed 1966 1975 1993（第三版）,Industry Enzymology,Tony Godfrey 1983 1996 第二版,Food Chemistry,Owen R.Fennema 1996 第三版 第7章 P431P530,Source Book of Food Enzymology,Sigmund Schnimmer 1981,食品酶学 王璋 1990,Food Enzymes Structure and Mechanism,Dominic W.S.Wong 1995,Hand Book of Food Enzymology,John R.Whitaker 2003,Marcel Deker,Inc.New York,第二节 酶的简短历史,最近70多年来酶学继续得到快速发展,酶学的简短历史,酶的发现,1833 Payen and Persoz在麦芽提取物的乙醇沉淀物中发现热不稳定物质，它能将淀粉转变成糖，后来此物质被称为amylase，当时它被命名为diastase，这是因为它有能力从淀粉颗粒的不溶性封皮中将可溶性糊精分离出来,amylase 淀粉酶,diastase 淀粉酶制剂,在19世纪中期发现了过氧化氢酶（catalase）、胃蛋白酶（pepsin）、多酚氧化酶（polyphenoloxidase）、过氧化物酶（peroxidase）和转化酶（invertase）,酶的本质,发酵不能离开活细胞的作用 organized ferment,酶的作用 unorganized ferment,酶是可以从生物细胞中分离出来的，它离开活细胞仍然能起催化剂作用。,名称,酶的起源,Origin of Name Enzyme,1878 Khne建议采用enzyme（希腊语“in yeast”）以避免使用名称unorganized and organized ferments。,酶的特异性（Enzyme Specificity）,1894 Fischer提出lock-and-key的酶和底物相互作用的概念,1959 Koshland提出酶底物结合的诱导楔合概念,Koshland保留了Fischer的概念即酶和底物之间形成立体有择络合物的概念，而拒绝了酶的活性部位的结合部位是刚性结构的概念,速度和反应的定量表示,1902年Henri和Brown各自提出了饱和曲线,1913年Michaelis和Menten推导出数学表达式,V=,Vmax(A),Km+(A),酶的纯化,酶的严格纯化开始于1920年之后,Willstatter和他的同事（1922-1928）纯化了Peroxidase,Although complete purity probably was not attained in any case,peroxidase was purified to the point where it showed appreciable activity at concentrations of protein below the detectability limits of existing protein assays,1926年J.B.Sumner得到urease结晶,一个组（Rockefeller Institute in New York）得到pepsin，trypsin，chymotrypsin and carboxypeptidase的结晶,开发了一系列纯化酶的方法,ion exchange cellulose,polyacrylamide gel as stabilizing media for electrophoretic,separations of enzymes,gel filtration,affinity chromatography,isoelectric focusing,chromatofocusing chromatography,hydrophobic interaction chromatography,酶的结构,1955年Sanger等报导胰岛素的氨基酸序列（顺序），MW6,000,1963年核糖核酸酶的一级结构被测定，MW13,683,采用Xray crystallography测定了ribonuclease，lysozyme，chymotrypsin，trypsin，papain和carboxypeptidaseA的三级甚至四级结构,1969年ribonuclease的完全化学合成,目前可利用recombinant DNA techniques合成酶，前提是gene能被分离出来,开创了一个新的方法测定酶的结构与功能的关系,在下述两个领域取得重大进展：,采用化学法和体外诱变法把酶的氨基酸侧链改性，定量解释上述改性对酶的催化性质和结构的影响。,阐明酶能如此高效的执行它们的功能的详细机制,第三节酶的一般特征,An enzyme is a protein with catalytic properties due to its power of specific activation.,酶是蛋白质,holoenzyme,Apoenzyme,Low molecular weight organic compound,Metal ion,Nonprotein part,Cofactor,Figure4,酶是催化剂,催化剂是一种能影响化学反应的速度而自己又没有作为反应的产物出现的物质,在理想的情况下催化剂不会被消耗,然而，甚至无机催化剂像钯和铂，也会中毒，于是实际上是被消耗的,但是，酶在失去它的活力（由于失活或副反应）之前已催化大量底物转变成产物,第十页公式,酶的作用是加速平衡的到达，即提高速度常数k1和k2，而不能改变k1/k2=Keg,In vitro酶的浓度在,10-8 to 10-6M,，In vivo酶的浓度要高的多,酶的效率用周转数（turnover number）表示，对于水解酶，它在,101102（sec1）范围，对于氧化还原酶它在106107（sec,1）范围。,周转数的定义：在酶被底物饱和的情况下，1 mole活性酶在1 sec（或min.）内将底物的多少mole数转变成产物。,Figure5,酶是特异的,键的特异性,基团特异性：对于它所作用的键的相靠近的基团的本质有特异性要求。,立体异构特异性：对于他所作用的底物的立体异构体特异性要求。,绝对特异性：酶作用于一特定底物催化发生特定的反应。,实例,目前可利用recombinant DNA techniques合成酶，前提是gene能被分离出来,开创了一个新的方法测定酶的结构与功能的关系,在下述两个领域取得重大进展：,采用化学法和体外诱变法把酶的氨基酸侧链改性，定量解释上述改性对酶的催化性质和结构的影响。,阐明酶能如此高效的执行它们的功能的详细机制,maltase maltose glacose,(-glucoside),-1,4-,糖苷键,cellobiase cellobiose glucose,(-glucoside),-1,4-,糖苷键,上述两个酶所催化水解的键仅存在微小的差别。,酶对食品、营养品和保健科学的重要性,食品科学家需要了解酶的本质,食品储藏和加工中的酶,许多重要的酶反应在植物、动物和微生物生长过程的开始就存在，当生物材料被收集起来作为食品时这些酶的过程仍然继续，例如果蔬被采收，动物被宰杀,动物被宰杀后，Krebs cycle和电子输送体系将停止，而糖酵解反应会继续进行至糖原和葡萄糖转变成乳酸、底物耗尽和不适合酶作用的pH出现。,水解酶，如蛋白酶、脂酶、磷酸酶和糖苷水解酶在动物死后很长时间还作用于细胞的组分。,由于合成代谢反应的停止和分解代谢的继续和加速，净的效果是组织损坏，这有助于提高食品的质量，如风味和质构。,在成熟的植物组织中出现酶的活动和数量的增加，淀粉转变成糖，叶绿素降解和细胞尺寸的快速增加。在没有气调的条件下水果会变得过熟和软糊。,最易控制的参数是,温度和底物,。把产品贮存在较低的温度可以推迟产品变得不能被接受的时刻的到来。然而，并非把原料的贮存温度控制得越低，它们的贮存期越长。这方面的实例是马玲薯的贮存。,高温,Starch dextrin maltose glucose oxidation,Potato softening,低温,starch sugar sugar oxidation,potato unacceptable sweet,browing of fried potato chip,Maillard reaction,caramelization reaction,在0或比0稍低导致组织中酶活力增加的原因：,1.水溶液相被浓缩,2.细胞被大的冰结晶破碎,决不要在05条件下保存食品，除非期望提高酶的活力。,In 1960,Emil Mark,in his introductory address to a symposium on food enzymes held at Oregon State University,sounded the call for mor,e fundamental work on enzymes by the food scientist.,Truly,the most fundamental work on enzymes is of interest to food technologists and belongs in a department of food technology just as much as in a department of biochemistry.,Both groups should be working on enzymes;however,the point of view may be different.The biochemist seeks knowledge of the enzymes whereas the food scientist working in the fundamental area of enzymology will always have in the back of his/her mind the use or control of these systems,yet the contribution of the two groups might be similar.By obtaining a thorough knowledge pertaining to the fundamentals of these reactions,we can do more in the way of preserving and producing better foods.,If we are to progress in our treatment of foods,in our production of better foods and the preservation of more foods,and if we are to create wealth by preservation,then we must get down to an understanding of the more fundamental aspects of enzymes.It is only the departments of food technology that look at these fundamental aspects that will make real progress in the future.(From Ref.38,pp.4 and 5,by courtesy of Avi Publishing Co.),第二章,酶的蛋白质本质,所有的酶都是蛋白质，但并非所有的蛋白质都是酶,蛋白质具有一级、二级、三级、四级结构以及大分子组织形式,第一节 一级结构,已从不同的天然来源分离出175种以上20种在蛋白质中发现。,有些蛋白质仅由氨基酸组成，被称为简单蛋白质（simple protein），像核糖核酸酶、胰凝乳蛋白酶。另一些蛋白质由氨基酸和有机化合物和/或无机离子组成，被称为结合蛋白质（conjugated protein）。,结合蛋白质,：,色蛋白（chromoprotein）,非血色素金属蛋白（non-heme metalloproteins）,脂蛋白（lipoprotein）,糖蛋白（glycoprotein）,磷蛋白（phosphoprotein）,需要各种辅助因子的酶,Table 1 Some Uses and Suggested Uses of Enzymes in Foods and Food Processing,铁卟啉（iron-porphyrin）作为辅助因子（cofactor），像血红蛋白（hemoglobin）肌红蛋白(myoglobin)过氧化氢酶(catalase)过氧化物酶(peroxidase),非血色素金属蛋白（non-hememetalloproteins）像铁蛋白（ferritin）羧肽酶A和B(carboxypeptidases A和B)碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）乙酸脱氢酶(alcohol dehydrogenase),脂蛋白（lipoprotein）,糖蛋白（glycoprotein）,磷蛋白(phosphoprotein)像酪蛋白(casein)胃蛋白酶(pepsin),需要各种辅助因子的酶,氨基酸和它们的性质,除脯氨酸（proline）和羟脯氨酸(hydroxyproline)外都是-氨基酸；除甘氨酸(glycine)外，都具有不对称C，具有光学活性，都是L-型（L-configuration）；苏氨酸羟基脯氨酸(hydroxyproline)异亮氨酸(isolencine)羟基赖氨酸(hydroxy-lysine)具有两个不对称C(asymmetric carbon),等电点的概念（Isoelectric point）,HendersonHasselbalch Equation,pH=pK+log(A-/HA),当酸的50%离解时，pK=pH,谷氨酸和天门冬氨酸具有两个酸性基团,赖氨酸精氨酸和组氨酸具有两个碱性基团，其实组氨酸分子中的咪唑基（imidazole）具有两性,（含有羟基的氨基酸SerThr，酚羟基Tyr，含巯基氨基酸Cys）,二,氨基酸相互作用形成肽键,C*为不对称C，具有四面体结构,肽键未能完全伸展，如完全伸展，两个氨基酸残基长度为8.64，实测为7.23。,R基团在平面上下交叉地配置,第二节 二级结构,在-螺旋结构中，任何相对移动都需要打破至少连续三个氢键,主链围绕着中心轴旋转而侧链向外伸展，残基n的C=O基和（n+1）残基的NH基形成氢键；每一残基过渡到次一残基在X轴方向移动1.5，移动100；每圈螺旋由36个残基构成，螺距为5.4。,-Pleated sheet,不同肽链之间或同一肽链的不同部位侧向的氢键缔合,平行和反平行两种形式,NCCNCC,NCCNCC,平行（parallel）,NCCNCC,CNNCCN,反平行（antiparallel）,第三节 三级结构,大多数酶近似地呈球状,Myoglobin：8个-螺旋片断，它们包括了118/153氨基酸残基，其他为非螺旋结构；它们进一步以复杂的非规则的方式折叠成紧密的三棱柱，453525,几乎所有极性氨基酸残基在表面，几乎所有的非极性残基在分子内部，亲水基暴露在溶剂水中，而疏水基尽可能的离开水。,三级结构中的键：,带相反电荷基团之间的静电作用（electrostatic bonds）,氢键（Hydrogen bond）,疏水键（Hydrophobic bond）,偶极键（dipolar bond）,二硫键（disulfide bond）,其中二硫键是最稳定的键。含有二硫键的胞外低分子量蛋白质一般来说是十分耐变性的。,-amylase虽不含有二硫键，但仍较稳定。其原因是含有Ca,2+,，它帮助维持三级结构。还原剂能打破二硫键-S-S-,蛋白质分子中某些键的能量和距离（相互作用的距离）,类型 能量(千焦/摩尔),共价键125-418,离子键42-84,氢键 8-40,范氏引力 4-12,第四节 蛋白质的水化（Hydration）,所有蛋白质都具有三级结构,与蛋白质分子直接接触的第一层水分子与蛋白质分子间的作用较强烈，随着距离增加，水分子受蛋白质的影响减弱。,直接测定被蛋白质结合的水分子的数量是相当困难的，一个原因是它并非恰好是一个单层；要确定离蛋白质分子多远，水分子不再受蛋白质分子影响同样是困难的。对于球蛋白，被固定的水为0.2-0.3克H2O/克蛋白质，对于分子量为18,000的蛋白质，每分子蛋白质能固定200-300 H2O分子。,Random coiled protein,such as gelatin,can immobilize as much as 99 times their weight of water(4)due to entrapment of water inside a thatch work of random coild protein molecules.,水分子并非均匀分布在蛋白质分子表面而是集中在较亲水的区域，所以在水溶液中蛋白质分子的形状部分地取决于水在它表面的结合。,第五节 蛋白质的四级结构,许多酶仅由一条肽链组成，例如，核糖核酸酶(ribonuclease)，溶菌酶(lysozyme)，胰蛋白酶(trypsin)，胃蛋白酶(pepsin)，-淀粉酶(-amylase),有大量酶和蛋白质由二个以上的多肽链组成，即形成四级结构,血红蛋白(Hemoglobin)2和2链组成,乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase)4条多肽链组成，即含两种不同类型的多肽链，H,4,H,3,M,H,2,M,2,HM,3,M,4,The two type of subunits can be separated.The catalytic subunits are fully active alone but there is no allosteric behavior of the enzyme in the absence of the regulatory subunits.,四级结构中的键,四级结构中不包括二硫键(-S-S-),疏水键和相反电荷基团的静电作用起着主要的作用,疏水侧链结合的百分数超过30%具有四级结构,疏水侧链结合的百分数少于30%，没有四级结构，是一条多肽链,第六节 酶的大分子组成(Macromolecular organization,of enzyme),酶以两种形式存在 完全溶解,膜结合,在电子输送过程中的酶系有规则地结合在一结构蛋白质上。当使用洗涤剂将蛋白质和脂质与酶分开时，酶系失去电子输送能力,可溶态酶以有组织状态存在的例子较少,丙酮酸脱氢酶复合物(Pyrurate Dehydrogenase Complex),从E.Coli 分离出来具有粒重量4.44million，由三种酶组合而成,E124丙酮酸脱羧酶(Pyrurate Decarboxylase),每分子的M.W.=90,000 此分子由两条不同的多肽链组成,E224二氢硫辛酸脱氢酶(Dihydrolipolyl Dehydrogenase),每分子的M.W.=55,000,E38硫辛酸乙酰移换酶(lipoyl trans acetylase),每分子的M.W.=120,000 此分子由三条多肽链组成,它们催化的总反应：,CH,3,COCO,2,+CoASH+NAD,CH,3,CoSCoA+CO,2,+NADH,大分子组织的重要性,整个过程的效率改变（增加）,整个过程在更为有控制的情况下进行,底物和中间产物在最终产物释放前可能被结合,复合物被环境因子激素和变构因子所控制,There is some evidence that aggregation of enzymes produces complexes which have activities unlike any of the enzymes separately.In a complex,the overall efficiency of the process can be altered.Since the substrate and intermediates appear to remain bound until the final product is released.Such a process could allow increased efficiency and more control over the rate of reaction since the complex is probably subject to control by environmental factors including hormones and allosteric effectors.,第三章 酶的提取和纯化,第一节 酶纯化的必要性,在食品加工过程中常需要将原料热处理以使酶失活。,测定上层清液中的某种最耐热的酶的残余酶活力以判断热处理条件是否恰当。,本实验的目的仅需要了解还有多少酶活残剩下来，不需要对酶的性质作进一步研究，此种酶萃取液称为crude extract。直接从crude extract 中测定酶的活力的条件是酶对底物有较高的特异性，得到上清液后就不需要将感兴趣的酶作进一步纯化。,如果许多酶作用于同一底物，那么从上述步骤得到的数据显然不能作为判断热处理程度的标准或依据。,检查一个酶液中蛋白酶的活力，用一个普通蛋白质作为底物所得到的结果可能是多种蛋白酶活力的综合结果。当然，也可以不经分离而采取一些措施分别测定个别酶的活力。,例如：一酶液中含有胰蛋白酶和胃蛋白酶,pH 2 8,胰蛋白酶活力 无 有,胃蛋白酶活力 有 无,也可以采用特异性底物,底物,N-acetyl-L-tyrosine ethyl ester -N-benzoyl-L-arginine ethyl ester,胰蛋白酶 无 有,胰凝乳蛋白酶 有 无,这个例子也仅仅是为了得到酶活力的数据，而且也是较粗略的，即使这样，有时还需要考虑将某些抑制剂分离出去。,测定过氧化物酶活力时，crude extract中的还原性化合物对酶具有抑制作用。,如果需要研究一个酶的氨基酸组成、分子量、三级结构、底物特异性、,动力学参数，那么必须将酶和其他物质完全分开，即纯化。,第二节 酶的提取,材料的选择,取决于研究工作的类型。,研究某种酶，不管它的来源，那么选择某种材料，其中含有大量该种酶即可以，例如从Horseradish 提取peroxidase，因为horseradish是已知的含peroxidase最多的植物。,如果需要研究一种特定材料中的特定的酶，则没有选择的余地，例如研究蘑菇中的多酚氧化酶。,从微生物培养改变生长介质的成分能诱导产生某种需要的酶，例如，细菌在仅含有maltose作为唯一碳源的介质中生成，可能会诱导产生高浓度的maltase.,酶浓度随生物体的年龄而变化。,聚半乳糖醛酸转移消去酶的活力（Bacillus Pumilus）,Activity of Polygalacturonic acid trans-eliminase(PATE)from Bacillus Pumilus,在植物中，某些酶存在于绿色水果中，而不是存在于成熟水果中，例如papay的papain；某些酶不存在于绿色水果中，而存在于成熟水果，例如tomato中的pectin enzyme。,酶的分布（Localization of enzyme）,水果和蔬菜：酶集中在表面或核附近。,从某一选择的部位中酶的浓度或许是10-100倍高于整个组织。一个部位的酶不同于另一个部位。,细胞含有亚细胞器溶菌体、线粒体、核、细胞膜；,differential centrifugation methods are available for separating the various organelles of the cell;,亚细胞水平的分级能导致酶的1020倍的富集。,酶的提取,冰浴、冷室和冷冻离心机是必需的设备。,大多数的酶在0左右是稳定的，微生物的生长是迟缓的。,如已得到均浆，应该尽快地进行下一步工作，如不得不推迟，可盖一薄层甲苯，以防止微生物污染。,将细胞和膜破碎以便将酶从组织中萃取出来。,制备丙酮粉,两个原则：,（1）将细胞破裂，将酶彻底地萃取到缓冲液。,（2）低温快速以防止酶的变性或失活。,对,可溶态酶,（soluble enzyme）采取低离子强度。,对,离子结合态酶,（ionic bound enzyme）采取高离子强度。,对,共价结合态酶,（covalent bound enzyme）采用纤维素酶处理。,果蔬材料中含有,酚类化合物,，在提取时可加入polyvinylpyrrolidone 或ethylene glycol 以除去这些酚类化合物。,如果组织中同时含有大量,蛋白酶,，除了在低温下快速工作外，可加入具选择性的抑制剂。,除去核酸,如果组织中含有大量核酸，它会干扰蛋白质（酶）分离，如有必要应在此阶段除去。,方法：调节pH至5.0,或加入碱性化合物产生沉淀,使用deoxyribonuclease或ribonuclease，但需注意因加入的酶制剂不纯所造成的污染。,热处理,根据各种酶蛋白质对热的不同稳定性，可以适当的热处理方法，将一些不耐热的酶蛋白质除去。当然，所需要回收的酶必须较耐热的。,第三节 纯化,蛋白质（酶）之间性质上的差别,溶解度（solubility）,电荷密度(charge density),电荷分布(charge distribution),水合(hydration),大小(size),形状(shape),密度(specific volume),特殊反应基团(special reaction group),相对稳定性(relative stability),分离蛋白质（酶）的方法（技术）就是根据上述这些性质设计的。,二、分离方法,下表总结了分离蛋白质（酶）的主要方法。,酶纯化中的主要分离方法,性质 方法 规模,离心 大或小,大小或质量 凝胶过滤 小,透析、超滤（纳米滤、小,微滤、反渗透）,电荷 离子交换色谱 大或小,电泳 小,等电聚焦（聚焦色谱）小,溶解度 改变pH 大,改变离子强度 大或小,降低介电常数 大,特殊结合位置 亲和色谱 小,亲和洗提 大或小,疏水性 疏水相互作用 小,三、主要分离方法的概述,沉淀技术,吸附作用,absorbent gel Aluminium hydroxide和tricalcium phosphate,吸附剂凝胶 氢氧化铝 磷酸三钙,离子交换色谱（Ion exchange chromatography）,The criteria be used in selecting a gradient is that it changes the least in the region where the desired protein is being eluted.The best resolution is obtained when the gradient is zero in this region.,一般地说，在离子交换色谱中，柱的尺寸不是非常重要的。如被分离的蛋白质质量较大，可用较大直径的柱。柱的长度一般地说对分辨率影响不大。在stepwise gradient 洗脱中，如盐浓度每次变化将得到一个蛋白质峰，那么柱的长度对分辨的重要性是不大的，如果多于一个峰，那么柱长将影响结果。并非desired物质总是被吸附在柱上，如desired物质具有极端的pI，则让其它组分被吸附在柱上而让desired物质通过柱收集起来，一次即可达到相当大程度的纯化。,柱的长度一般地说对分辨率影响不大。在stepwise gradient 洗脱中，如盐浓度每次变化将得到一个蛋白质峰，那么柱的长度对分辨的重要性是不大的，如果多于一个峰，那么柱长将影响结果。并非desired物质总是被吸附在柱上，如desired物质具有极端的pI，则让其它组分被吸附在柱上而让desired物质通过柱收集起来，一次即可达到相当大程度的纯化。,凝胶过滤色谱（Gel filtration chromatography）,电泳(Electrophoresis),聚焦色谱(chromatofocusion),亲和色谱（Affinity chromatography）和亲和洗提(Affinity elution),在亲和色谱中，象底物或竞争性抑制剂那样的分子通过共价键与惰性载体（例如琼脂糖）相连接，形成亲和载体。这些分子和需要纯化的酶之间具有特异性的相互作用。当混合物通过填充有亲和载体的柱子时，仅此种酶保留在柱子中，其它的酶和蛋白质被洗出柱子。然后加入底物，凭借此时它对酶分子结合部位的竞争作用，或者改变溶液的pH或离子强度，削弱酶对亲和载体的结合，都可以使结合的酶解吸。,整个过程如图所示,亲和洗提是互补于亲和色谱的一项技术。对于亲和色谱，相互作用的特异性表现在吸附阶段上；对于亲和洗提相互作用的特异性从色谱的支持材料解吸这一阶段。在亲和洗提中，有意义的酶（蛋白质）和其他化合物一起首先吸附到一种离子交换剂上（如DEAE-纤维素），然后用适当的底物特异地洗提。,四、酶纯化步骤的设计,目标和准则(Aims and criteria),目标：如果要研究一个酶（蛋白质）的组成或氨基酸残基的次序，它必须纯化到homogeneous，如果要研究它的结构和功能，还必须保持他的天然状态。,准则：酶（蛋白质）分离需要满足下列诸条件：,所要求的纯度，高回收率，方法的经济性。,初步知识：,应尽可能的了解被纯化的酶（蛋白质）以及试样的性质。,并不是一定要知道一个被分离的酶（蛋白质）的全部细节，有些性质要在它被分离后才能完全清楚。然而，它的个别性质对于将要采用的一些分离方法还是很重要的。,例如：,sizegelfiltration,chargedensityionexchange,biological propertiesaffinity chromatography,所采取步骤的顺序,纯化步骤的顺序从理论上讲是不重要的，只要能达到最终除去杂质的目的，各个步骤编排的顺序是无关紧要的。然而，两个步骤之间的连接是重要的，因为一个步骤对试样性质的影响，将会决定那一个步骤必须接着跟上，这就是所谓两个相邻步骤的compatibility。,例如：dialysis or gelfiltration 会稀释样品，跟着的下一步骤应是具有浓缩作用的步骤。,例如：salt precipitation 后，sample 中盐的浓度太高，因而不能采用ionexchange chromatography，如想采用必须先安排一部脱盐步骤。,例如：在开始阶段必须处理大量样品，因此，high capacity 是优先考虑的，而high resolution 可放在后期考虑。,整个分离程序中应包括根据不同的selectivity 的步骤,例如：根据分子大小分离的步骤不能除去杂质，可再用根据电荷性质不同的分离步骤进一步纯化。,整个酶（蛋白质）纯化的过程分为几个阶段,初步纯化,选择性纯化步骤,检查纯化的进展情况,进一步纯化,五、纯化步骤的定量评价（Quantitation of purification steps）,每一步骤是否成功必须测定酶的活力和蛋白质含量，同时比较它们。酶的活力用unit/ml表示。测定酶的活力可任意选择一种方法，但必须让他人便于重复。蛋白质浓度表示方法是mg/ml。比活力是指 酶活力/蛋白质浓度比活力（某一步后）,Purification data should be kept in a balance skeet(见“食品酶学”参考教材 p58 表3-3),纯化过程中蛋白质的损失是无关紧要的，而酶活力的损失是至关重要的。当然，酶活力的损失是不可避免的。How much loss of enzyme can be tolerated will depend upon how much starting material is available and how much enzyme is needed at the end。,纯化倍数不是一个纯度的指标，这取决于在初始材料中酶的百分含量。,酶的百分含量纯化倍数纯度,