微生物的培养与利用---上课.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,生态系统的结构,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,生态系统的结构,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,到目前为止，,几十项,Nobel,生理学和医学奖，化学奖,都与,微生物学,有关,微生物,类群,原核生物界,原生生物界,真菌界,病毒界,(,细菌、放线菌、蓝藻,),(,酵母菌、霉菌、食用菌,),(,草履虫、变形虫、衣藻,),(,噬菌体、艾滋病毒,),特点：结构,简单、,个体,微小、,生长周期,短、,类群,大、,易,培养，,易,变异，,进化地位低。,观察仪器：光学显,微镜或电子显微镜,无细胞结构,原核细胞,真核细胞,微生物包含了除,植物界,和,动物界,以外的所有生物,一、微生物,病毒,如图是酵母菌电子显微镜下的形态结构,酵母菌和霉菌,青霉,细菌的代谢类型,自养型：,硝化细菌、铁细菌、硫细菌等。,异养型,：大肠杆菌、酵母菌、乳酸菌、枯草杆菌等。,枯草杆菌、硝化细菌、铁细菌、根瘤菌等。,破伤风杆菌、乳酸菌等。,需氧型：,厌氧型：,同化作用,异化作用,微生物的培养与利用,目标：,1,、,一个核心概念,：培养基,2,、,两种计数方法,：,1,）显微镜计数法,2,）菌落计数法,3,、,三种基本技术,：,1,）无菌技术,2,）倒平板技术,3,）接种技术,获得纯净的微生物，一方面要为培养的微生物提供,合适的营养和环境条件,，另一方面需要确保,其他微生物无法混入,。,一、培养基,1,、概念：为人工培养微生物而制备的，提供适合微生物,_,或积累,_,的,营养基质,。,繁殖,生长、,代谢产物,2,.营养成分：,各种培养基的具体配方不同，但,基本都含有水、碳源、氮源和无机盐。,不同培养基除基本成分外，还要满足不同微生物对,pH,、特殊营养物质以及氧气,的要求。,含义,作用,主要来源,碳源,凡能提供所需碳元素的物质,构成生物体细胞的物质和一些代谢产物,无机化合物：,NaHCO,3,、,CO,2,（,只能被自养微生物利用,）,有机化合物：糖类、脂肪酸、花生饼粉、石油等（,异养微生物利用；既是碳源又是能源,）,氮源,凡能提供所需氮元素的物质,合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物,无机化合物：,N,2,（只能被固氮微生物利用，如根瘤菌）,NH,3,、,铵盐、硝酸盐,（,大多数微生物利用）；,营养,要素,生长,因子,生长必不可少的微量有机物,酶和核酸的组成成分,维生素、氨基酸、碱基等,水和无,机盐,水不仅是优良溶剂，而且可维持生物大分子的稳定；无机盐是细胞内成分和调节物质,外界摄入,关键点1,（,1,）,某些微生物之所以,需要补充生长因子，是由于其体内缺乏合成这些物质所需要的酶或合成能力有限,（,2,）,含,C,、,H,、,O,、,N,的,有机物,是,异,养型微生物的,碳源,、,氮源,、,能源,关键点2,自养微生物和异养微生物的营养比较,小结,：（,1,）自养微生物与异养微生物,划分依据是,能否以无机碳,作为生长的主要或唯一碳源，而与氮源无关。,营养类型,碳源,氮源,生长因子,自养型,微生物,CO,2,、,NaHCO,3,等含碳无机物,NH,3,、铵盐、,硝酸盐等,一般不需要,异养型,微生物,糖类、脂肪酸等,铵盐、硝酸盐、蛋白质等,有些微生,物需要,（,2,）自养微生物的能源,利用光能,，如蓝藻等。,依靠物质氧化过程中释放的能量,，如硝化细菌，能利用,NH,3,氧化过程中释放的化学能，因此,NH,3,既作为氮源，又作为能源。,按,物理状态,不同划分,固体培养基,液体培养基,半固体培养基,菌种扩大培养、工业生产,含琼脂,，用于菌落鉴定、分离和计数,观察微生物运动、保存菌种,3,、种类：,固体培养基,液体培养基,有,无,凝固剂琼脂,分离 鉴定,工业 生产,物理性质：,半固体培养基,无动力 有动力,(,弥散,),用于,动力检测、保种,液体培养基（,用于增菌,）,表面生长,均匀混浊生长,沉淀生长,按,化学组成,不同划分,天然培养基,合成培养基,半合成培养基,按,化学组成不同,划分：合成培养基,/,天然培养基,化学成分明确，主要用于,分类、鉴定,化学成分不明确，主要用于工业生产,部分成分明确，部分不明确，,用途最广,。,如：牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯培养基,按,用途,不同划分,鉴别培养基,选择培养基,可在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长。,鉴别培养基是根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成的，用以鉴别不同种类的微生物。,用于区别不同微生物种类,培养分离特定微生物,培养基中加氨苄青霉素,具有抗氨苄青霉素能力的菌落,选择出没有抗氨苄青霉素能力的,工程菌,没有抗氨苄青霉素能力的菌落被淘汰,选择培养基,功能划分：,思考：以下选择培养基可以分离哪些微生物？,（1）加入高浓度食盐的培养基,杀死多种微生物，,分离出金黄色葡萄球菌,（2）不加氮源的无氮培养基,分离出自生固氮菌,（,非固氮菌因缺少氮源被淘汰）,（3）不加含碳有机物的无碳培养基,分离出自养型微生物,（异养微生物因缺少有机物被淘汰）,（,4,）加入石油为唯一碳源,分离出石油微生物,如：假单胞杆菌,（,5,）用普通培养基在无氧条件下,分离出,“,厌氧型或兼性厌氧型微生物,”,如：乳酸菌、酵母菌、,（,6,）加入青霉素、四环素等抗生素的培养基,杀死细菌、放线菌，,分离酵母菌、霉菌等真菌,鉴别培养基,在培养基中加入,伊红和美蓝,，可以用来鉴别饮用水和乳制品中是否存在大肠杆菌等细菌：,如果有大肠杆菌，其代谢产物就与伊红和美蓝结合，使,菌落呈深紫色，并带有金属光泽,。,大肠杆菌在伊红美蓝培养基上生长,例、下表为培养某种微生物的培养基配方，下列相关叙述错误的是,(,),成分,NaNO,3,K,2,HPO,4,KCl,MgSO,4,7H,2,O,FeSO,4,(CH,2,O),H,2,O,青霉素,含量,3 g,1 g,0.5 g,0.5 g,0.01 g,30 g,1 000 mL,0.1,万单位,A,依物理性质划分，该培养基属于液体培养基,B,依用途划分，该培养基属于选择培养基,C,培养基中的唯一碳源是,(CH,2,O),，唯 一氮源是,NaNO,3,D,若用该培养基培养纤维素分解菌，则应除去,(CH,2,O),，再添加纤维素,D,4,.培养基的配制原则,(见导学案),作业,1,：整理完成导学案，并收交,课前回顾,：,1,、微生物的类群包括哪些？,2,、微生物的营养要素包括哪几部分？,3,、自养微生物和异养微生物的碳源有什么不同？,4,、微生物最常利用的氮源是什么？固氮微生物的氮源是？硝化细菌的氮源是？,5,、生长因子的主要来源是什么,?,培养微生物时培养基中是否加入生长因子取决于什么？,6,、分离微生物时所用的培养基从物理状态和用途划分各,属于哪种类型？,7,、鉴别大肠杆菌用什么指示剂？有什么现象？,微生物实验室培养的基本操作程序,1、器具的灭菌,2、培养基的配制,3、培养基的灭菌,4、倒平板,5、微生物接种,6、恒温箱中培养,7、菌种的保存,8、微生物的计数方法及鉴定,二、实验操作,准备工作,（一）无菌技术,为什么在实验过程要使用无菌技术？,防止实验室的培养物被其他外来微生物污染；,避免操作者自身被微生物感染。,实验操作空间消毒,操作者的手、衣着消毒,实验用具灭菌,实验操作过程,1.,具体范围及操作方法,超净工作台,酒精灯火焰旁操作,消,毒,与,灭,菌,条件,结果,常用的方法,消毒,较为,温和,的物理或化学方法,仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物,(,不包括芽孢和孢子,),煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外线或化学药剂消毒法,灭菌,强烈,的理化因素,杀死物体内外,所有的微生物,，包括芽孢和孢子,灼烧灭菌、,干热灭菌、,高压蒸汽灭菌,灭菌的原理是：,蛋白质变性，同时损伤,DNA,的结构。,2,、无菌的方法,芽孢,有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做,芽孢,。,芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力,。例如，有的细菌的芽孢，煮沸,3,小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当,环境适宜,（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌,.,孢子,放线菌、原生动物、真菌和植物等产生的,一种有繁殖或休眠作用的生殖细胞。能直接发育成新个体。,种类,主要方法,应用范围,巴氏消,毒法,70,75,煮,30 min,或,80,煮,15 min,牛奶、啤酒、果酒和酱油等不宜进行高温灭菌的液体,煮沸消,毒法,100,煮沸,5 min,6 min,日常食品、罐装食品,紫外线,消毒法,紫外线照射,30 min,接种室、接种箱等,化学药物消毒法,用体积分数为,70%,75%,的酒精、碘酒涂抹，来苏水喷洒等,用于皮肤、伤口、动植物组织表面消毒、手术器械、塑料或玻璃器皿等,（,1,）常见的消毒方法,15,30min,100kPa,，,121,培养基、实验器材,高压蒸汽灭菌,1,2h,干热灭菌箱（160,170 ）,耐高温需干燥的物品（玻璃器皿等）,干热灭菌,烧红,酒精灯火焰充分燃烧层灼烧,接种的工具、试管口、瓶口,灼烧灭菌,灭菌时间,所需条件,适用对象,灭菌方法,灼烧灭菌,干热灭菌箱,高压蒸汽灭菌锅,（,2,）灭菌,湿热灭菌（高压蒸汽灭菌）过程：,1,、加水,2,、装锅,3,、加热排气,维持,23min,排出冷空气,4,、保温保压,气压,100Kpa,、温度,121,、,维持,2030,分钟。,5,、出锅,压力表指针降至,“,0,”,点，温度下降。,例,.,培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手、空气、牛奶所采用的灭菌或消毒方法依次是（）,化学消毒 灼烧灭菌 干热灭菌 紫外线消毒 高压蒸汽灭菌 巴氏消毒法,A.B.,C.D.,A,氧元素、氢元素,H,2,O,（,定容,1000ml,）,无机盐,NaCl,（,5g,）,碳源、氮源、维生素,蛋白胨（,10g,）,碳源、氮源,、磷酸盐、,维生素,牛肉膏（,5g,）,提供的主要营养,培养基组分,（一）牛肉膏蛋白胨培养基,培养细菌的基础培养基,1,、营养配方,边做边学：大肠杆菌的接种与分离培养,3、注意事项,（1）牛肉膏蛋白胨的,称量,要迅速，防止,蛋白胨,吸收空气中的水分,（2）,溶化,时要,不断搅拌，防止琼脂糊底而导致烧杯破裂；,（3）,搁置斜面,/,倒平板,2、步骤：,计算、称量溶化,调,PH,分装、包扎,灭菌,搁置斜面,/,倒平板,（二）、倒平板,约,50,灼烧灭菌，,防止瓶口的微生物污染培养基,既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,倒平板操作的讨论,1.,培养基灭菌后要冷却到,50,O,C,时倒平板。用什么办法来估计培养基的温度？,用手触摸锥形瓶，温度下降到,刚刚不烫手,时即可开始倒平板。,3,、配制斜面培养基作用是什么？试管为什么要加塞棉塞？,增大接种面积；保持通气并防止杂菌污染。,2.,为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？,通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。,4.,平板冷凝后，为什么要将平板倒置？,5.,在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，,既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此,最好不要,用这个平板培养微生物。,5,、鉴定培养基制作是否合格的方法：,将制备好的培养基放在恒温箱中保温1-2天，看有无菌落生长,如果没有，则说明制作合格；反之，不合格。,（三)大肠杆菌分离和纯化,1、目的：,获得 目的微生物,2、培养基类型：选择培养基,3、分离方法：平板划线法、稀释涂布平板法,4,、接种工具：接种环、接种针、玻璃刮铲等,（四）接种技术,1、概念：,无菌,条件下将,微生物,接入培养基的操作过程,2、工具：,接种环、接种针、玻璃刮铲等,3、方法：,平板划线法、稀释涂布平板法,、,混合平板法、斜面划线接种法、穿刺接种法等,平板划线法,:,通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。,目的：数次划线后,可以分离成由单个细胞形成单个的,菌落。,单个,或少数菌体,2.,特征：,大小、形状、光泽度、,颜色、透明度等。,3.,功能：,1.,定义：,菌落,作为微生物,鉴定、分类,的依据,固体,培养基上,大量繁殖,子细胞群体,当固体培养基表面众多菌落连成一片则称为,菌苔,。,平板划线法：,菌种,划,3,个平板,1,个不划线,接种环,防止划破培养基,（重复实验）,（空白对照）,一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；,二是存留在划破处的单个细胞无法形成规则的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。,1.,为什么菌种前以及除第一次划线外其余每次划线之前都要灼烧接种环？,答：,取菌种前灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；,除第一次划线外其余,每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。,问题讨论,2.,在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,以免接种环温度太高，杀死菌种。,3.,在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,4.,在作第二次以及其后的划线操作时，每次从上一次划线的末端开始划线的原因和目的是什么？,原因：,划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次,从上一次划线的末端开始,，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少；,目的：,最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,(2)、稀释涂布平板法,将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养。,稀释涂布平板法,a.梯度稀释菌液,b.分别涂布平板,6,支试管，分别加入,9ml,无菌水,1ml,10,1,1ml,10,2,1ml,10,3,1ml,10,4,1ml,10,5,1ml,10,6,a.,梯度稀释菌液：,菌液,微量 移液器,注意：,移液管需要经过灭菌。操作时，试管口和移液管离火焰12cm处.,b.,涂布平板：,不超过,0.1ml,各梯度分别涂布,3,个平板,1,个不涂布作空白对照,滴,灼,试,涂,稀释,10,3,倍,稀释,10,4,倍,稀释,10,5,倍,各个环节要保证“无菌”,涂布平板操作的步骤,(1),将涂布器浸在盛有,70,的酒精,的烧杯中。,(2),取少量菌液（不超,0.1mL,），,滴,加到培养基表面。,(3),将沾有酒精的涂布器在火焰上,引燃,，火熄后,冷却,8,10s,。（,烧,）,(4),用涂布器将菌液均匀地,涂,布在培养基表面。,涂抹平板法和混合平板法的异同,1),过,程,如,图：,见教材,第,17,页,2),结果不同：,涂抹平板法：,细菌菌落通常仅在平板表面生长,。,混合平板法：,细菌菌落出现在平板表面及内部,。,3),目的相同：分离各种目的微生物。,（五）、培养及对照处理：,将,接种后,的培养基和一个,未接种,的培养基,放入,37,恒温箱中培养,12h,24h,后，,观察并记录,对照处理,1.,培养,12h,和,24h,后，观察到的实验结果相同吗？如果不同，请分析产生差异的原因？,2.,如果在培养基上观察到不同形态的菌落，请分析其可能的原因。,培养,12 h,与,24 h,后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同。随着时间的延长、菌落的不断生长，使菌落不断增大。,无菌操作未达到要求：可能是培养基灭菌不彻底；可能是接种时发生了污染；也可能是在培养的过程中受到了污染。,结果分析与评价,（六）、结果分析与评价,培养基的制作是否合格,如果未接种的培养基在恒温箱中保温,1,2 d,后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。,接种操作是否符合无菌要求,如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习,。,（七）、菌种保藏：,短期保存：,上,4,保藏，,缺点,是菌种易被污染或产生变异。,长期保存：采用,20,冷冻箱中保藏。,固体斜面培养基,甘油管藏法,（,1ml,甘油,1ml,菌液）,（八）微生物的鉴定,1、原理,2、依据：菌落或菌苔的特征,3、培养基类型：鉴别培养基（按用途划分）,4、实例,1,、分解纤维素的微生物的分离,1,）纤维素酶的组成及作用,组成：一种,酶，它至少包括三种组分，即,。,作用：,复合,C,1,酶、,C,x,酶和葡萄糖苷酶,纤维二糖,葡萄糖,纤维素,+,染料红色复合物,（纤维素,+,）,+,刚果红染料 培养基中出现以纤维素分解菌为中心的,刚果红,纤维素酶,透明圈,2,）实验原理,3),培养基：是以,为唯一碳源的选择培养基。,4,）筛选流程,土壤取样,将样品涂布到,的培养基上,挑,选,的菌落。,纤维素粉,选择培养,梯度稀释,鉴别纤维素分解菌,产生透明圈,不同菌落的透明圈大小不同可以说明微生物体分解纤维素酶能力的大小。,2,、,土壤中分解尿素的细菌的分离,(1),分离原理：,土壤中细菌之所以能分解尿素，是由于它们能合成,，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起,作用。,使用以,为唯一氮源的培养基能促,进,细菌的生长和繁殖，并抑制或阻止其,他微生物的生长，从而分离出目的菌。,脲酶,催化,尿素,分解尿素,鉴定方法：,在以尿素为唯一氮源的培养基中加入,酚红指示剂,，利用此培养基进行细菌培养，观察培养基的颜色变化（,红色菌落,）。,1,、间接计数法,(,活菌计数法,),：,原理,：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。,计算公式,：每克样品中的菌株数,(,C,V,),M,，其中,C,代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，,V,代表涂布平板时所用的稀释液的体积,(mL),，,M,代表稀释倍数。,（九）统计菌落数目的方法,特别提醒,统计菌落数目的注意事项：,实验时，每一浓度至少涂布,3,个平板,，以增强实验的说服力和准确性。,一般选择菌落数在,30,300,的平板进行计数。,统计的菌落数往往比活菌的实际数目,低,。,统计结果一般用,菌落数,而不是用,活菌数,表示。,设置,对照,。排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。,2.,显微镜直接计数法,采用,细菌计数板,或,血球计数板,，显微镜下直接计数,（计算一定容积里样品中微生物的数量）。,取清洁无油的血球计数板，在计数室上面加盖血盖片。,取酵母菌液，摇匀，用滴管由盖玻片边缘滴一小滴，使菌液自行渗入，计数室内不得有气泡。,用,10,镜观察并将计数室移至视野中央。在,10,镜下计数：计数,4,个（或,5,个）中格,的平均值，然后求得每个中格的平均值。乘上,16,（或,25,）就得出计数区总菌数，最后再换算到每,mL,菌液中的含菌数。,注意事项：,计上不计下，计左不计右。,显微镜直接计数法,缺点：,不能区分死菌与活菌；,不适于对运动细菌的计数；,个体小的细菌在显微镜下难以观察；,（,09,宁夏理综）,32,生物选考题,A,生物,选修,I,生物技术实践,某小组同学为了调查湖水中细菌的污染情况而进行了实验。实验包括,制备培养基、灭菌、接种及培养、菌落观察计数,。请回答与此实验相关的问题。,（,1,）培养基中含有的蛋白胨、淀粉分别为细菌培养提供了,_,和,_,_,。除此之外，培养基还必须含有的,基本成分,是,_,和,_,。,（,2,）对培养基进行灭菌，应该采用的方法是,_ _ _,。,碳源,氮源,无机盐,高压蒸汽灭菌,水,（,09,宁夏理综）,32,生物选考题,（,3,）为了尽快观察到细菌培养的实验结果，应将接种了湖水样品的平板置于,_,中培养，培养的温度设定在,37,。要,使该实验所得结果可靠,，还应该同时在另一平板上接种,_,作为对照进行实验。,（,4,）培养,20,小时后，观察到平板上有形态和颜色不同的菌落，这说明湖水样品中有,_,种细菌。一般说来，菌落总数越多，湖水遭受细菌污染的程度越,_,。,（,5,）如果提高培养基中,NaCl,的浓度，可以用于筛选耐,_,细菌，这种培养基被称为,_,。,恒温培养箱,无菌水,多,高,盐（或,NaCl,）,选择性培养基,