生物制药-第二章-生物制药技术通论-模块01--生物药物的制备技术.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第一节 生物药物的制备技术,一、,材料选择,二、,材料的预处理,三、,提取技术,四、,固液分离技术,五、,纯化、结晶,六、,浓缩、干燥,一般工艺程序,生物材料,胞内产物,胞外产物,细胞碎片,提取液,浓缩液,初步分离产物,高度纯化产物,产品（原料药）,细胞破碎,浓缩,提取技术,沉淀、膜分离,层析、电泳、结晶,浓缩、干燥,一般工艺程序,RETURN,固液分离技术,固液分离技术,选择原则：,1、,来源丰富、成本低、目的物含量高、易于分离纯化的材料,材料来源丰富，而含量不高；,或材料来源丰富、含量高，但材料的杂质含量太多，分离纯化手续繁琐，以致影响质量和收率，反而不如采用低含量易于操作的原料；,2、,种属特异性、发育阶段、生理状态、解剖部位等因素的影响,种属特异性,影响到原料中待提取蛋白质的含量、结构、生物学活性及其抗原性。,例如：来源于猪垂体的生长素对人体无效，不能用于人体。,被提取蛋白质的原料中的含量还受到原料,解剖部位,的影响。,例如：,猪胰脏,尾,部含激素较多，,猪胰脏头,部含消化酶较多，单独收集胰头提取消化酶，收集胰尾提取激素，有利于提高产率。,一、材料的选择P17,RETURN,3、化学法和酶法,方法：有机溶剂法、自溶法、酶解法、表面活性剂处理法。,有机溶剂法,是于0以下在粉碎后的新鲜材料中加入510倍量的丙酮，迅速搅拌，可破碎细胞，亦使蛋白质与脂质分开，有利于进一步的纯化。,表面活性剂处理法,是利用细胞膜对表面活性剂不稳定的原理来破碎细胞。如：,十二烷基硫酸钠（SDS）,、氯化十二烷吡啶、去氧胆酸钠。,自溶法,是利用细胞自身的蛋白酶将细胞破坏，使细胞内含物释放出来。自溶法所需的时间长，不易控制，难以在工业上使用。,酶解法,适用于细菌、植物等含细胞壁的材料，如：利用溶菌酶、纤维素酶、半纤维素酶、蜗牛酶、酯酶等专一性的酶水解细胞壁，得到细胞的内含物。,二、生物材料的预处理 组织与细胞的破碎方法,RETURN,（一）提取类型与影响因素,三、提取技术,1、提取类型,（1）,固液提取（又称浸取、浸提、抽提）：,目标物在细胞中呈固相或与固体结合存在，提取时由固相转入液相，称为固液萃取，常用萃取剂为水。,（2）,液液提取（又称萃取）：,目标物已呈液相存在，萃取时由液相转入另一液相，称为液液萃取，因常用有机溶剂作为萃取剂，所以也叫溶剂萃取。,三、提取技术,2、影响因素,（1）溶解度的大小,：选择合适溶剂，一般遵守“相似相溶”的原则。,（2）扩散速度：,增加温度、降低溶液的黏度、增加扩散面积、减少扩散距离、搅拌和延长时间等。,提取原则：“,少量多次,”，对于等量的提取溶液，分多次提取比一次提取的效果好。,（二）提取方法,三、提取技术,1、水溶液提取,2、表面活性剂提取,3、有机溶剂萃取,1、水溶液提取,三、提取技术,水溶液（一般为缓冲液）是生物药物提取中最常用的溶剂，可以利用,水或稀酸、稀碱、稀盐溶液,进行提取。,“盐溶”作用,：盐离子的存在能减弱生物分子间离子键及氢键的作用力，,稀盐溶液,可促进蛋白质等生物大分子的溶解。,“盐解”作用,：某些与细胞结构结合牢固的生物活性物质，在提取时采用,高浓度盐溶液,（如,4mol/L,盐酸胍，,8mol/L,脲或其他变性剂）。,2、表面活性剂提取,三、提取技术,一些采用水盐系统难于提取的,蛋白质、酶、核酸,，可采用表面活性剂提取。,离子表面活性剂,（如胆酸盐、十二烷基磺酸钠）,如：十二烷基磺酸钠（,SDS,），利于破坏核酸与蛋白质的离子键合，对核酸酶又有一定抑制作用，因此常用于核酸的提取。,非离子表面活性剂（,如吐温,60,、吐温,80,等）。,3、有机溶剂萃取,三、提取技术,对于水不溶性的,脂类、脂蛋白、膜蛋白结合酶,等，可采用有机溶剂进行提取。,常见的有机提取溶剂有,乙醇、,丙酮,、丁醇,。,单一溶剂分离法,多种溶剂组合分离法,如先用,丙酮,，再用,乙醇,，最后用,乙醚,提取，可以从,动物脑,中依次分离出,胆固醇,、卵磷脂和,脑磷脂,。,3、有机溶剂萃取,三、提取技术,常用丙酮处理某些生化原材料，制成,“丙酮粉,”。,作用：,使材料脱水、脱脂；,细胞结构松散，增加稳定性，有利于活性成分的提取；,同时又减少了体积，便于贮存和运输。,应用丙酮粉提取，可以减少提取液的乳化程度及黏度，有利于离心与过滤操作。,4、双水相萃取技术,三、提取技术,两种亲水性聚合物混合溶于水中，低浓度时可以得到均匀单项液体体系；随着各自浓度的增加，溶液会变得浑浊；当各自达到一定浓度时，就会产生互不相溶的两相。两相都以水分为主，所以形成高聚物,-,高聚物双水相体系。,类型：,（,1,）高聚物,/,高聚物双水相体系,（,2,）高聚物,/,无机盐双水相体系,（,3,）低分子有机物,/,无机盐双水相体系,（,4,）表面活性剂双水相体系,双水相的形成,如葡聚糖与聚乙二醇按一定比例与水混合，静置平衡后，分成互不相溶的两个水相，上相富含PEG，下相富含葡聚糖,5,、超临界流体萃取技术,三、提取技术,在超临界区，无论压力有多高，分子之间的距离会缩小，密度会增大，但分子之间都有一定的距离，依旧不会变成液体。这种既不是气体也不是液体的物质状态，称为“流体”，即,超临界流体。,常见的超临界流体还有,二氧化碳、乙烷、丙烷,等。,超临界状态下的流体对溶质的溶解度大大增加，是良好的分离介质，根据这些特性发展起来的萃取技术称为超临界流体萃取技术。,80年代超临界二氧化碳萃取技术泛用于香料的提取。90年代后，超临界二氧化碳萃取技术用于从药用植物中提取药用有效成分等。,CO,2,超临界萃取装置,四、固液分离技术,固液分离技术,膜分离技术,过滤分离技术,离心分离技术,传统过滤技术,离心过滤技术,离心沉降技术,（一）过滤分离技术,1、定义：以多孔性物质为过滤介质，在外力（重力、压力或离心力）作用下，流体（液体或气体）及小颗粒固体通过介质孔道，而大的固体颗粒被截留，从而实现流体与固体颗粒分离的技术。,2、分类：,（1）,重力过滤,（2）,加压过滤,（3）,真空过滤,（4）,离心过滤,（5）,膜过滤,利用悬浮液自身的重力为过滤动力，速度慢，效率低,利用气压或泵为过滤动力，推动液体前进，常用的方法,反向端抽真空，形成负压，抽出液体，设备成本高,利用离心力作为料液推动力，速度快，成本高,利用选择性半透膜作为分离介质层，允许混合物中的某些组分透过而截留其他组分的一种分离技术。,重力过滤,加压过滤,真空过滤,离心过滤,（一）过滤分离技术,3、过滤介质和助滤剂,（1）过滤介质：,滤布,或,膜,（2）助滤剂：要求为惰性物质、无毒、有一定细毒及硬度，成本低廉。,常用有：,硅藻土、纸浆、石棉、纤维素,等,过滤介质,介质种类,材料,应用,无定形颗粒,煤渣、沙粒、活性炭,澄清过滤,成形颗粒,烧结金属、玻璃、塑料,澄清过滤,非金属织布类,棉布、化学纤维,普通过滤,金属织布类,不锈钢丝网,普通过滤,无纺品,滤纸、无纺滤布、滤膜,精密过滤,RETURN,（二）离心分离技术,1、定义,离心分离技术,是利用旋转产生的离心力的作用，促使不同大小、不同密度的颗粒分离的技术。,2、分类,按分离原理分2种：离心沉降、离心过滤,按工作目的分2种：制备、分析,按离心速度分3种：低速、高速、超速,离心机,低速离心机,高速冷冻离心机,不同转速离心机比较,类型,低速离心机,高速离心机,超速离心机,转速rpm,8000,10000,25000,25000,150000,RCF（,g,）,氧化铝硅胶氧化镁碳酸钙磷酸钙石膏纤维素淀粉和糖。,活性炭,白陶土,氧化铝,大孔吸附树脂,可分为,非极性、中等极性、极性和强极性吸附剂,四类。,美国罗姆,-,哈斯公司：,Amberlite,系列；,日本三菱化成公司：,Diaion,系列。,吸附剂及被吸附物极性对吸附的影响,“,类似物容易吸附类似物,”的原则,：,极性吸附剂,易吸附,极性物质,，,非极性吸附剂,易吸附,非极性物质,；,极性吸附剂适宜从非极性溶剂中吸附极性物质；,非极性吸附剂适宜从极性溶剂中吸附非极性物质。,洗脱剂的选择,极性溶质,：极性大的溶剂洗脱能力就大；,非极性溶质,：极性小的溶剂洗脱能力就大。,常用洗脱剂排序（极性增大）：,石油醚甲苯 乙醚氯仿 乙酸乙酯 丙酮 乙醇甲醇 水 乙酸,氧化铝或硅胶(极性强)为吸附剂,洗脱剂从极性低的开始,逐渐增加极性,。,次序：石油醚、甲苯、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、水、乙酸。,活性炭(非极性)为吸附剂,洗脱剂从极性高的开始,逐渐降低极性,。,次序：水、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿。,吸附层析装置,（2）凝胶过滤层析,gel chromatography,凝胶过滤层析也称,分子筛层析,、,排阻层析,，是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。当混合物随流动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其,分子大小,不同而被分离的技术。,特点：,该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高。,原理：,凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，像筛子；小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。,当含有分子大小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时，这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。,大分子物质,沿,凝胶颗粒间隙,随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱；而,小分子物质,可通过,凝胶网孔,进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱，从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。,凝胶过滤层析原理,凝胶过滤,适合于分离蛋白质、酶、核酸、抗体等生物大分子,（3）离子交换层析,ion exchange chromatography,基本原理：,离子交换层析：利用溶液中,带电粒子,与离子交换剂之间,结合力,的差异进行物质分离的操作方法。,带电粒子与离子交换剂间的作用力是,静电力,。,电荷密度、电荷种类,离子交换层析原理,离子交换剂,离子交换剂：由,惰性的不溶性载体,、,功能基团,和,平衡离子,组成。,阳离子,交换剂：平衡离子带,正电荷,。,阴离子,交换剂：平衡离子带,负电荷,。,R,-,X,+,+Y,+,R,-,Y,+,+X,+,R,-,表示,阳离子,交换剂的,功能基团和载体,；,X,+,为,平衡离子,；,Y,+,为,交换离子,。,离子交换树脂吸附和洗脱过程,（1）X,+,为平衡离子，YH,+,及Z,+,为待分离离子；,（2）YH,+,和Z,+,取代X,+,而被吸附；,（3）加碱后YH,+,失去正电荷，被洗脱；,（4）提高X,+,的浓度取代出Z,+,离子交换的基质,带有,正电荷,的称之,阴离子交换树脂,，如：二乙氨基乙基纤维素，,DEAE-,纤维素）；,带有,负电荷,的称之,阳离子交换树脂,，如：,羧甲基纤维素,，,CM-,纤维素）。,基质是由带有电荷的,树脂,或,纤维素,组成。,目的物是弱酸性或弱碱性的,小分子,物质时，宜选用,强酸强碱树脂,（氨基酸的分离）,。,蛋白质、酶,和其它,生物大分子,的分离多采用,弱碱或弱酸性树脂,，减少生物大分子的变性，利于洗脱，提高选择性。,树脂的选择,离子交换树脂的命名,强酸类,1,100,号；,弱酸类,101,200,；,强碱类,201,300,；,弱碱类,301400,；,中强酸类,401,500,交联度,：是合成载体骨架时交联剂重量的百分数，用“”将树脂编号与交联度分开。,弱酸101,4其交联度为4。,国内常用树脂命名：,724,；,732,；,717,常用树脂,724,；,弱酸,阳离子交换树脂,732,；,强酸,阳离子交换树脂,717；,强碱,阴离子交换树脂,常用的离子交换纤维素,羧甲基纤维素（CM-C）：,弱酸性阳离子交换纤维素，pK=3.6。,二乙基氨基乙基纤维素（DEAE-C）：,强碱型阴离子交换纤维素，pK=9.1。,离子交换层析,树脂的,树脂的预处理,A.物理处理：去杂，过筛。,B.,化学处理,：用810倍的1mol/L 盐酸或氢氧化钠溶液交替浸泡。,氨基酸分离前树脂的处理,不同类型树脂的处理,树脂的再生,树脂再生：,使用过的树脂重新获得使用性能的处理过程。,再生过程：,A.去杂，大量水冲洗，除去物理吸附的杂质。,B.用酸、碱处理除去与功能基团结合的杂质。,C.转型：,离子交换纤维素的处理和再生,酸碱浓度要适当降低，,处理时间也从,4h,缩短为,0.31h,。,以交换缓冲液平衡。,注意：,不耐酸,，用酸处理的浓度和时间须小心控制。,（4）亲和层析,(Affinity Chromatography),利用生物大分子物质具有与某些相应的分子,专一性可逆结合,的特性而建立的层析技术。,适用:从成份复杂且杂质含量远大于目标物的混合物中提纯目标物。,抗体抗原,酶底物,DNA或RNA互补链,特点,经过一次处理可得到,高纯度活性,物质,；,特异性强,、分离效果好、分离条件温和,；,亲和吸附剂通用性较差，,专用的吸附剂,。,A配基,B配体,原理,（1）,配基固定化,：配基与,载体,偶联，结合成具有特异亲和性的分离介质。,（2）,吸附样品,：亲和层析介质选择性吸附生物活性物质.,（3）,样品解吸,：选择适宜的条件使被吸附物活性物质解吸。,技术要点,（,1,）找与底物,专一可逆结合,的配基；,（,2,）将配基通过,共价键,偶联到基质；,（,3,）配基,与,底物,吸附,；,（,4,）洗脱目标物。,亲和层析,层析装置（试验室和工厂）,4、电泳技术,（1）原理,各种带电分子（如蛋白质）在同一pH条件下，因,分子量,和,电荷数量,不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。,在确定的条件下，,带电粒子,在单位电场强度作用下，单位时间内移动的距离（即,迁移率,，,Rm值,）为常数，是该带电粒子的物化特征性常数。,电泳技术,电泳基本设备,电泳仪,主要功能是提供稳压稳流直流电源，就是一直流稳压稳流器,电泳槽,电泳系统的核心部分，各种支持介质的容器，电泳行为发生处,电泳槽,关键词：,1、电极,2、胶板,3、上槽,4、下槽,5、样品池,6、点样,7、前沿,8、Rm值,（2）电泳类型,移动界面电泳,区带电泳,等电聚焦电泳,等速电泳,区带电泳,在一定的,支持物,上，于均一的载体电解质中，将样品加在中部位置，在电场作用下，样品中带正或负电荷的离子分别向负或正极以不同速度移动，分离成一个个彼此隔开的区带。,按支持物的物理性状不同，又可分为:,A.纸电泳,B.纤维膜电泳,C.粉末电泳,D.凝胶电泳,E.丝线电泳,电泳结果图,电泳图谱：是在电泳后经染色获得的。,染色的方法依据分离的分子性质决定,等电聚焦电泳,等电聚焦电泳是利用一种,两性电解质,作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的,pH梯度,，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自,等电点,的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。,5、结晶技术（,Cystallization）,结晶：从液相或气相生成形状一定，分子（原子、离子）,有规则排列,的晶体的现象。,（1）特点,选择性高,纯度高,（2）结晶过程,形成过饱和溶液,晶核形成（有时需添加晶种）,晶体生长,过饱和是结晶的推动力,一次结晶得到的产品总会有一些杂质，为了提高晶体的纯度，必须将晶体用合适的溶剂溶解再次结晶，这个过程称为,重结晶,。,冷却法,蒸发法,盐析结晶法,透析结晶法,有机溶剂结晶法,等电点法,化学反应结晶法,调节溶液的pH或向溶液中加入反应剂，生成新物质，结晶析出。,（3）过饱和溶液的形成(结晶方法),温度诱导法,盐析结晶法,透析结晶法,等电点法,化学反应结晶法,综合利用,结晶设备,浓缩结晶罐,冷冻结晶系统,串联结晶系统,各种结晶,胱氨酸,酪氨酸,细胞色素P450,血清白蛋白,六、浓缩、干燥,（一）浓缩技术,使溶液中溶剂蒸发、溶液浓度增大的过程。,1、蒸发浓缩,2、冷冻浓缩,3、膜过滤浓缩,蒸发浓缩,凡是液体均可用蒸发的方法进行浓缩。,传统蒸发，就是加热使液料沸腾而使汽体飞入空间。,现代蒸发则改用,低温、低压蒸发,的方法，以免损坏有效成分。,旋转蒸发仪（器）,冷冻浓缩,利用冰与水溶液之间的固液相平衡原理的一种浓缩方法。,冷冻浓缩的操作包括两个步骤，首先是部分水分从水溶液中结晶析出，而后将冰晶与浓缩物加以分离。,冷冻浓缩方法特别适用于,热敏药物,的浓缩。,中药悬浮结晶冷冻浓缩装置及流程,1、回转制冰机；2、大皮带轮；3、小皮带轮；4、减速电机；,5、制冷机；6、低温药液泵；7、滤网；8、冰晶；9、药液罐,膜分离浓缩,合成药、原料药及中间体的脱盐浓缩纯化,中草药及植物提取液浓缩,发酵液纯化浓缩,医药化工污水MBR处理,制药纯化水设备,如通过半透膜的只是溶剂，则溶液获得了浓缩，此过程称为膜浓缩。,（二）干燥技术,用,热能,加热物料，使物料中水分蒸发而干燥或者用,冷冻法,使水分结冰后升华而除去的单元操作。,通常是生物产品分离的最后一步。,1、低温真空干燥；,2、喷雾干燥；,3、冷冻干燥。,干燥类型,瞬时快速干燥,：接触时间短、气流温度高,喷雾干燥,：,时间短、热效低、可同时造粒,气流干燥,：接触时间较长,沸腾干燥,：接触时间最长，热效最高,冷冻干燥,：,适用于粘稠状物料，活性保持最好,微波干燥,：时间短，效率高,红外干燥,：温度高，干燥速度快,干燥装置,真空干燥箱,电热鼓风干燥箱,真空干燥器,喷雾干燥器（机）,1、喷雾气体电磁阀,2、三向电磁阀,3、压力调节器,4、喷气压力感应器,5、喷嘴,6、输液压力感应器,7、输液泵,8、试料搅拌器,9、进气口过滤罩,10、风速感应器,11、加热器,12、进气口温度感应器,13、蒸发管,14、喷嘴清洗口,15、分离器,16、出气口温度感应器,17、涡旋管,18、回收瓶,19、排气扇,喷雾干燥,冷冻干燥,使被干燥的液体在极低的温度下，冷冻成固体；然后，在,低温、低压,下利用水的升华性能，使冰,升华,汽化而除去，以达到干燥的目的；,冷冻干燥法适用于绝大多数生物产品的干燥和浓缩，可以最大限度地保证生物产品的活性。,冷冻干燥器（机）,真空泵,冷冻干燥,胰脏,胰pancreas是人体的第二大消化腺，胰腺分为外分泌腺和内分泌腺两部分。外分泌腺由腺泡（腺细胞）和腺管组成。腺泡分泌胰液，腺管是胰液排出的通道。胰液中含有碳酸氢钠、胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等。胰液经各级导管，流入胰腺管。胰腺管与胆总管共同开口于十二指肠。胰液通过胰腺管排入十二指肠。,内分泌腺是由散在于外分泌腺之间大小不同的细胞团胰岛所组成。胰岛分泌的激素叫胰岛素，直接进入血液和淋巴，主要参与调节糖代谢。胰岛素分泌不足，可引起糖尿病。,胞内成分,捣碎机,十二烷基硫酸钠,英文名称：dodecyl sulfate，sodium salt；简称：SDS,白色或淡黄色微粘物，工业上常用于洗涤剂和纺织工业。属阴离子表面活性剂。易溶于水，与阴离子、非离子复配伍性好，具有良好的乳化、发泡、渗透、去污和分散性能，广泛用于牙膏、香波、洗发膏、洗发香波、洗衣粉、液洗、化妆品和塑料脱模，润滑以及制药、造纸、建材、化工等行业。,细胞自溶（autolysis）,酵母在45-50,下保温20小时左右，即可发生自溶。,盐溶（salting in）,高效液相层析（色谱）,气相层析（色谱）,层析方式,薄板层析,纸层析,薄膜层析,柱层析,