紫外可见分光光度法.ppt

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,第三章,紫外,-,可见分光光度法,仪 器 分 析,学习目的,通过本章学习，为后续药物分析、中药分析课程中有关药品的定性鉴别、杂质检查和含量测定的学习奠定基础。,学习要点,紫外,-,可见分光光度法的基本原理；,电子跃迁类型，吸收带的类型、特点及影响因素；,Lambert-Beer,定律；,紫外,-,可见分光光光度计的基本构造；,定性定量方法。,目 录,第一节 紫外,-,可见分光光度法的基本原理,第二节 紫外,-,可见分光光度计,第三节 紫外,-,可见分光光度法分析条件的选择,第四节 紫外,-,可见分光光度法的应用,紫外-可见分光光度法,(,ultraviolet-visible spectrophotometry，UV-Vis,)是基于分子中价电子跃迁所产生的吸收光谱而进行分析的方法，又称紫外-可见吸收光谱法。,该法波长范围一般在190800nm。,特点：,灵敏度较高，一般为10,-,7,10,-,4,g/ml；,准确度较好，相对误差一般在0.5%，精度高的可达0.2%；,仪器设备简单，操作方便，分析速度较快。,概述,一、紫外,-,可见吸收光谱,（一）电子跃迁的类型,1,、,*,跃迁,2,、,*,跃迁,3,、,n ,*,跃迁,4,、,n ,*,跃迁,5,、电荷迁移跃迁,6,、配位场跃迁,第一节 紫外,-,可见分光光度法的基本原理,电子跃迁所需能量及所处波段示意图,*,n,*,*,n*,5,、电荷迁移跃迁,用电磁辐射照射化合物时，电子从给与体向接受体相联系的轨道上跃迁称为电荷迁移跃迁。,某些取代芳烃分子同时具有电子给与体和电子接受体两部分，可以产生电荷转移吸收光谱。,某些过渡金属离子与含生色团的试剂反应所产生的配合物，以及许多无机物离子均可产生电荷迁移跃迁。,此类吸收带较宽，吸收强度大，一般,max,10,4,。,（一）电子跃迁的类型,6,、配位场跃迁,第,4,、,5,周期过渡金属水合离子或过渡金属离子与显色剂所形成的配合物在电磁辐射作用下，吸收适当波长的紫外光或可见光，从而获得相应的吸收光谱。,配位场跃迁吸收强度较弱，一般,max,10,2,。,如,Ti(H,2,O),6,3+,水合离子的配位场跃迁吸收带,max,为,490nm,。,大多数镧系和锕系元素离子的,4f,或,5f,电子可发生,ff*,跃迁（配位场跃迁），因而在紫外,-,可见光区都有吸收。,（一）电子跃迁的类型,8,跃迁,类型,出现波段,吸收,强度,化合物,结构,特点,*,200nm,弱,单键,C,C,C,H,饱和烃类，对紫外无贡献，但可作溶剂,*,200nm,强,不饱和键,C,C,CC,有共轭双键存在时，,*,跃迁所需能量降低，波长红移,n,*,250,500nm,弱,C,O,C,N,等,必须是杂原子直接连在双键上,n,*,200nm,弱,C,OH,C,NH,2,C,S,C,X,含有未共用电子对的基团连接在,键上,杂原子极性,，,红移,杂原子数目,，,红移,电子跃迁类型及特点,1,、吸收光谱（吸收曲线）,2,、生色团,3,、助色团,4,、蓝移、红移,5,、增色效应、减色效应,（二）紫外-可见吸收光谱中的常用术语,1,、吸收光谱（吸收曲线）,(1),最大吸收波长（,max,）,吸收曲线上的最大吸收峰所对应的波长。,(2),最小吸收波长（,min,）,吸收曲线上的最低部位的谷所对应的波长。,(3),肩峰,（,sh,）,吸收峰上的曲折处称为肩峰。,(4),末端吸收,在吸收曲线的最短波长处呈现强吸收而不成峰形的部分称为末端吸收。,有机化合物分子结构中含有n,*,、,*,跃迁的基团，,能在紫外-可见光范围内产生吸收的基团。,如C=C、,C=O,、N=N等简单的双键或叁键，以及,C,O,、,C,N,、,C,S,、,N,O,、,NO,2,等,有杂原子渗入的双键或共轭双键,。,2,、生色团,含有非成键电子的杂原子饱和基团，本身不能吸收波长大于,200nm,的辐射，但与发色团或饱和烃相连时，能使生色团的吸收峰向长波方向位移并增强其吸收强度的基团。,如NH,2,、OH、NR,2,、OR、SH、SR、Cl、Br等。,这些基团中的 n电子能与生色团中的电子相互作用（可能产生p-共轭），使*跃迁能量降低，跃迁几率变大。,3,、助色团,(1),蓝移（紫移、短移）,因化合物的结构改变或溶剂效应等引起的吸收峰向短波方向移动的现象,(2),红移（长移）,因化合物的结构改变或溶剂效应等引起的吸收峰向长波方向移动的现象,4,、蓝移、红移,(1),增色效应,由于化合物的结构发生某些变化或外界因素的影响，使化合物的吸收强度增大的现象,(2),减色效应,由于化合物的结构发生某些变化或外界因素的影响，使化合物的吸收强度减小的现象,5,、增色效应、减色效应,（三）吸收带,依据电子跃迁和分子轨道类型，吸收带可分为：,1,、,R,带,Radikal(,基团,),2,、,K,带,Konjugation(,共轭作用,),3,、,B,带,benzenoid(,苯,),4,、,E,带,芳香族化合物特征吸收带,1,、,R,带,Radikal(,基团,),由含杂原子不饱和基团（,C,O,、,NO,、,NO,2,、,N,N,）的n,*,跃迁引起。,吸收峰处于较长波长范围（,250500nm,）内，吸收强度中等（,100,）。,2,、,K,带,Konjugation(,共轭作用,),由共轭双键中,*,跃迁引起。,吸收峰出现在,200nm,以上，吸收强度大（,10,5,）。,随着共轭双键的增加，吸收峰红移，吸收强度有所增加。,如丁二烯,max,=217nm,为,K,带。,3,、,B,带,benzenoid(,苯,),芳香族（包括杂芳香族）特征吸收带。,由苯等芳香族化合物的,*,跃迁所引起的吸收带之一。,吸收峰出现在,230270nm,之间，中心波长,256nm,。,在极性溶剂中，,B,带精细结构变得不明显或消失。,苯的紫外吸收光谱（异辛烷溶剂中）,4,、,E,带,芳香族化合物特征吸收带,由苯环结构中,3,个乙烯的环状共轭系统的,*,跃迁所引起。,分为,E,1,和,E,2,两个吸收带。,E,1,吸收带约在,184nm,，,max,=60000,，强吸收带。,E,2,吸收带在,204nm,以上，,max,=8000,，强吸收带。,苯的紫外吸收光谱（异辛烷溶剂中）,电子结构,化合物,跃迁,max,（,nm,）,max,吸收带,乙烷,*,135,10 000,乙烯,*,165,10 000,乙炔,*,173,6000,和,n,丙酮,*,约,160,16 000,n,*,194,9000,n,*,279,15,R,-,CH,2,=CH-CH=CH,2,*,217,21 000,K,-,和,n,CH,2,=CH-CHO,*,210,11 500,K,n,*,315,14,R,芳香族,苯,芳香族,*,约,180,60 000,E,1,同上,约,200,8000,E,2,同上,255,215,B,一些化合物的电子结构、跃迁和吸收带,21,1,、,有机化合物的紫外吸收光谱,2,、影响紫外吸收光谱的主要因素,（四）紫外-可见吸收光谱与分子结构的关系,22,(1),饱和化合物,饱和碳氢化合物只有电子，因此只能产生,*,跃迁，需要能量较大，吸收的波长通常在150nm左右的真空紫外光区。,含有,O,、,N,、,S,、,X,等杂原子的饱和化合物，除,电子外，还有,n,电子，可发生,n,*,跃迁，在,200nm,附近有弱吸收，通常为末端吸收。,仅少数化合物（如烷基碘）的,max,为,259nm,（,max,=400,）。,在200400nm的近紫外区没有强吸收（常称为透明）。,在紫外吸收光谱分析中常作溶剂。,1,、,有机化合物的紫外吸收光谱,23,(2),不饱和烃及共轭烯烃,含孤立双键或叁键的简单不饱和脂肪化合物，可以产生*和,*,两种跃迁。,最大吸收波长,max,小于,200nm,。,具有共轭体系的不饱和化合物，共轭体系越长，跃迁时所需能量越小，吸收峰红移越显著。,如,1,3,5,7,9,11-,十二烷基六烯,max,为,364nm,，,max,为,138000,。,1,、,有机化合物的紫外吸收光谱,(3),羰基化合物,羰基化合物含有C=O基团，可发生n,*,、n,*,和,*,跃迁。,其中n,*,跃迁所需要能量较低，吸收波长在近紫外光区或紫外光区，,为,10100,。,醛、酮、羧酸及其衍生物(酯、酰胺、酰卤等)，均属于这类化合物的吸收类型。,、,-,不饱和醛、酮，由于C=O和C=C双键共轭，使,*,跃迁红移至,200nm,以上，,约为,10,4,；而,n,*,跃迁,红移至,310350nm,（,100,）。,如,CH2,=CH,-,CHO，共轭,*,跃迁,max,为,210nm,，n,*,跃迁,max,为,315nm,。,1,、,有机化合物的紫外吸收光谱,(4),芳香族化合物,苯具有环状共轭体系，在紫外光区，由,*,跃迁产生E1带、E2带和B带3个吸收带。,B带是芳香族化合物的特征。,当苯环上引入NH,2,、OH、CHO、NO,2,基团时，苯的B带显著红移，吸收强度增大。,如果引入的基团带有不饱和杂原子时，则产生了n,*,跃迁的新吸收带。,如硝基苯、苯甲醛的n,*,跃迁的吸收波长分别为330nm和328nm。,1,、,有机化合物的紫外吸收光谱,2,、影响紫外吸收光谱的主要因素,分子的内部结构和外部环境等各种因素对吸收谱带也有一些，主要表现为谱带位移、谱带强度的变化、谱带精细结构的改变等。,(1),位阻影响,(2),跨环效应,(3),溶剂效应,(4),体系pH值的影响,(1),位阻影响,化合物中若有两个生色团产生共轭效应，可使吸收带长移。,但如果两个生色团由于立体阻碍妨碍它们处于同一平面上，就会影响共轭效应。,二苯乙烯由于顺式结构有立体阻碍，苯环不能与乙烯双键在同一平面上，不易产生共轭，因此反式结构的K带,max,比顺式明显红移，且吸收系数也增加。,2,、影响紫外吸收光谱的主要因素,二苯乙烯顺式反式异构体的紫外吸收光谱,2,、影响紫外吸收光谱的主要因素,(2),跨环效应,跨环效应指非共轭基团之间的相互作用。,如对亚甲基环丁酮在214nm处出现一中等强度的吸收带，同时284nm处出现R带。,这是由于结构中虽然双键与酮基不产生共轭体系，但适当的立体排列，使羰基氧的孤电子对与双键的电子发生作用，相当于n,*,跃迁的R带向长波移动。,对亚甲基环丁酮,2,、影响紫外吸收光谱的主要因素,(3),溶剂效应,n,*,随溶剂极性的增大，吸收峰向短波移动。,*,随溶剂极性的增大，吸收峰向长波移动。,极性溶剂对两种跃迁能级差的影响示意图,2,、影响紫外吸收光谱的主要因素,溶剂极性对异丙叉丙酮的两种跃迁吸收峰的影响,跃迁类型,正己烷,三氯甲烷,甲醇,水,*,230nm,238nm,237nm,243nm,n,*,329nm,315nm,309nm,305nm,对称四嗪的吸收光谱,a.蒸气态中 b.环己烷中 c.水中,极性溶剂往往使吸收峰的精细结构消失,2,、影响紫外吸收光谱的主要因素,(4)体系pH值的影响,体系酸碱度对酸碱性有机化合物吸收光谱的影响普遍存在。,如酚类化合物由于体系pH值不同，其解离情况不同，而产生不同的吸收光谱。,max,210.5nm,（,max,6200,）,236nm,（,max,9400,）,270nm,（,max,1450,）,287nm,（,max,2600,）,2,、影响紫外吸收光谱的主要因素,二、朗伯-比尔定律,朗伯-比尔定律(Lambert-Beer)是光吸收的基本定律，是分光光度法定量分析的依据和基础。,如果浓度c以物质的量浓度（mol/L）表示，则公式可以写成,其中称为摩尔吸收系数，单位为L/（mol,cm）。,如果浓度c以质量百分浓度（g/100ml）表示，则公式可以写成,其中称为百分吸收系数，单位为100ml/（g,cm）。,吸收系数两种表示方式之间的关系是：,（一）,数学表达式及物理意义,例 某种从中药提取物分离纯化制得的有效成分，浓度为12.6g/ml，用1cm吸收池，在最大吸收波长238nm处测得其吸光度为0.437，试计算其 （,max,）；若该组分的分子量是264，计算其（,max,）。,解：已知c=12.6g/ml=12.610,-,6,100=1.2610,-,3,(g/100ml),朗伯,-,比尔定律公式运用,1,、化学因素,2,、光学因素（非单色光，杂散光，散射光和反射光，非平行光）,（二）偏离朗伯-比尔定律的因素,吸光物质可因浓度的改变而发生离解、缔合、溶剂化以及配合物生成等变化，使吸光物质的存在形式发生变化，从而偏离朗伯-比尔定律。,C,6,H,5,COOHH,2,O=C,6,H,5,COO,H,3,O,max（nm),273 268,max,L/(mol,cm),970,560,稀释溶液或改变溶液pH值时，吸收波长及吸收系数都会改变。,1,、化学因素,2,、光学因素,(1),非单色光,(2),杂散光,(3),散射光和反射光,(4),非平行光,(1),非单色光,比尔定律只适用于单色光，实际用于测量的都是具有一定谱带宽度的复合光，谱带宽度越小，单色性越好。,谱带宽度,应选择曲线较为平坦,的最大吸收波长,a,处测定,2,、光学因素,2,、光学因素,(2),杂散光,从单色器得到的单色光中，还有一些不在谱带范围内的、与所需波长相隔甚远的光，称为杂散光。,它是由于仪器光学系统的缺陷或光学元件受灰尘、霉蚀的影响而引起的。,在透光率很弱时，杂散光会产生明显的作用。,在接近紫外末端吸收处，杂散光的比例相对增大，从而干扰测定，有时还会出现假峰。,2,、光学因素,(3),散射光和反射光,吸光质点对入射光有散射作用，吸收池内外界面之间入射光通过时会有反射作用。,散射和反射作用致使透射光强度减弱。,真溶液散射作用较弱，可用空白进行补偿。,混浊溶液散射作用较强，影响结果测定，故要求被测溶液为澄清溶液。,2,、光学因素,(4),非平行光,倾斜光通过吸收池的实际光程将比垂直照射的平行光的光程长，使吸光度增加，影响测量值。,透光率测量误差（T）来自仪器的噪声。,浓度测量结果的相对误差（c/c）与透光率测量误差关系可由朗伯-比尔定律导出：,浓度测量的相对误差取决于透光率,T,和透光率测量误差,T,的大小。,相对误差与透光率的关系,（三）透光率测量误差,一、主要部件,光源,单色器,吸收池,检测器,信号显示系统,第二节 紫外,-,可见分光光度计,（一）光源,光源的作用是提供激发能，使待测分子产生吸收。,1,、,光源的要求,发射连续辐射,光；,有足够的辐射强度及良好的稳定性；,辐射强度随波长的变化应尽可能小；,光源的使用寿命长，操作方便。,（一）光源,2,、,光源的种类,常用的光源有热辐射光源,（如,钨灯、卤钨灯,）,和气体放电光源,（,如氢灯和氘灯,）,两类。,(1),钨灯和碘钨灯：,3402500nm,，可见光区内辐射强度与工作电压的,4,次方成正比。,(2),氢灯和氘灯：,160375nm,，氘灯比同功率的氢灯光强度大,35,倍。,(3),激光紫外光源：高强度、高单色性，氩离子激光器、可调谐染料激光器。,单色器是从光源的复合光中分出单色光的光学装置，其主要特点是产生光谱纯度高、色散率高且波长可调节。,由进光狭缝、准直镜、色散元件、聚焦元件和出光狭缝等几个部分组成，核心部件是色散元件。,（二）单色器,单色器光路示意图,棱镜色散与光栅色散,（二）单色器,1,、色散元件,(1),棱镜：利用折射率差别制成。,(2),光栅：利用光的衍射与干涉作用制成。每,1mm,玻璃上刻,6001200,条槽。,每条刻线相当于,1,条狭缝，光在未刻部分发生反射，各反射光束间的干涉引起色散。,（二）单色器,2,、准直镜,以狭缝为焦点的聚光镜。,将进入单色器的发射光变成平行光；,将色散后的平行单色光聚集于出光狭缝。,（二）单色器,3,、狭缝,狭缝宽度直接影响单色光的纯度。,狭缝过宽，单色光不纯；狭缝过窄，光通量过小，灵敏度降低。,定性分析宜采用较小的狭缝宽度。,定量分析宜采用较大的狭缝宽度。,（二）单色器,4,、杂散光及其消除,杂散光：指出射光束中混有的与仪器所指示的波长相差较大的光波。,杂散光会严重影响吸光度测定。,杂散光产生的原因：各光学部件和单色器的外壳内壁的反射；大气或化学部件表面尘埃的散射；光学元件霉变、腐蚀。,可将单色器用罩壳封闭起来，罩壳内涂有黑体以吸收杂散光。,即比色皿，用于盛放待测溶液的容器。,1,、光学玻璃吸收池 可见光区,2,、熔融石英吸收池 可见光区、紫外光区,用于盛放供试液和参比液的比色皿，应厚度相同，两只比色皿的透光率之差小于,0.5%,。,（三）吸收池,将光信号转变成电信号的光电转换元件，其产生的电信号与照射光强度成正比。,要求：,在测量范围内具有高灵敏度；,对辐射能量的响应快、线性关系好、线性范围宽；,对不同波长的辐射影响性能相同且可靠；,稳定性好，噪声水平低。,（四）检测器,1,、光电池,2,、光电管,3,、光电倍增管,4,、光二极管阵列检测器,（四）检测器,1,、光电池,硒光电池：敏感光区,300800nm,，易疲劳，寿命短。,硅光电池：紫外光区及可见光区。,（四）检测器,2,、光电管,以一弯成半圆柱形的金属片为阴极，阴极内表面镀有碱金属或碱金属氧化物等光敏层；,在圆柱形的中心置一金属丝为阳极，可接受阴极释放的电子。,两电极密封于玻璃管或石英管内并抽真空。,红敏光电管,(,镀有银和氧化铯,),可用于,6251000nm,波长。,蓝敏光电管,(,镀有锑和铯,),可用于,200625nm,波长。,光电管灵敏度高，光敏范围宽，不易疲劳。,（四）检测器,光电管检测器示意图,3,、光电倍增管,一种加上多级倍增电极的光电管,。,外壳由玻璃或石英制成，阴极表面涂有光敏物质，在阴极与阳极之间装有一系列次级电子发射极，即电子倍增极。,辐射光子撞击阴极时发射光电子，该电子被电场加速并撞击第一倍增极，撞出更多电子，依次进行，最后阳极收集到的电子数是阴极发射电子的,10,5,10,6,倍。,（四）检测器,光电倍增管示意图,光电管输出的电信号很弱，需经过放大才能以某种方式将测量结果显示出来，一般的分光光度计多具有荧屏显示、结果打印及吸收曲线扫描等功能。,现代的分光光度计装备有计算机光谱工作站，可对数字信号进行采集、处理与显示，并对各系统进行自动控制。,（五）信号处理和显示系统,1,、单光束分光光度计,2,、双光束分光光度计,3,、双波长分光光度计,4,、全波长分光光度计,二、分光光度计的类型,在单光束光学系统中，单色器色散后的单色光进入吸收池。,经单色器分光后形成一束平行光，轮流通过参比溶液和样品溶液，以进行吸光度的测定。,这种简易型分光光度计结构简单，操作方便，维修容易，适用于常规分析。,（一）单光束分光光度计,光源发出光经单色器分光后，经旋转扇面镜（切光器）分为强度相等的两束光，一束通过参比池，另一束通过样品池，光度计能自动比较两束光的强度，此比值即为试样的透射比，经对数变换将它转换成吸光度，并作为波长函数记录下来。,双光束分光光度计一般都能自动记录吸收光谱曲线。,由于两束光同时分别通过参比池和样品池，因而能自动消除光源强度变化所引起的误差。,（二）双光束分光光度计,由同一光源发出的光被分为两束，分别经过两个单色器，得到两束不同波长的单色光。,利用切光器使两束光以一定频率交替照射同一吸收池，然后测定两个波长处的吸光度差值,A,。,A=A,1,A,2,=(,1,2,)lc,（三）双波长分光光度计,优点：,双波长分光光度计只利用,1,个吸收池，消除了吸收池及参比池所引起的测量误差；,用同一光源得到两束光，可减小因光源电压变化产生的影响。,（三）双波长分光光度计,光电二极管阵列（,PDA,）是在晶体硅上紧密排列一系列光电二极管检测管，光经全息光栅表面色散并透射到二极管阵列检测器上，被其中的光二极管接受。,二极管输出的电信号强度与光强度成正比。,两个二极管中心距离的波长单位称为采样间隔。,二极管数目越多，分辨率越高。,（四）全波长分光光度计,全波长分光光度计同时检测透过样品复色光。,它具有灵敏度高、噪音低、线性范围宽等优点，可用作高效液相色谱检测器。,（四）全波长分光光度计,（一）光学性能,1,、辐射波长,2,、仪器的测量范围,3,、仪器的重复性及准确度,4,、杂散光,三、光学性能与仪器校正,1,、辐射波长,(1),波长范围：指仪器所能测量的波长范围，通常为,200800nm,。,(2),光谱带宽：指在最大透光强度一半处曲线的宽度，通常为,6nm,以下。,(3),波长准确度,：仪器所显示的波长数值与单色光的实际波长值之间的误差，规定紫外光区,1nm,，,500nm,附近,2nm,。,(4),波长重复性：重复使用同一波长，单色光实际波长的变动值，通常,1nm,。,三、光学性能与仪器校正,2,、仪器的测量范围,透光率表示：,-1.0%200.0%,吸光度表示：,-0.5A3.000A,3,、仪器的重复性及准确度,光度重复性：指同样情况下重复测量透光率的变动，通常,0.5%,。,光度准确度：指以透光率测量值的误差表示。透光率满量程误差为,0.5%,（铬酸钾溶液）,三、光学性能与仪器校正,4,、杂散光,通常以测光信号较弱的波长处所含杂散光的强度百分比为指标。,药典规定：,220nm,处,NaI,（,1g/100ml,）透光率,0.8%,，,340nm,处,Na,2,NO,2,（,5g/100ml,）透光率,0.8%,。,三、光学性能与仪器校正,1,、波长的校正,常用汞灯（,237.83nm、253.65 nm,等）或氘灯（,486.02 nm、656.10nm）,中的较强谱线进行校正。,高氯酸钬溶液校正双光束仪器。,2,、吸光度的校正,使用重铬酸钾的硫酸溶液，在规定的波长处测定并计算其吸收系数，并与规定的吸收系数比较，来检定分光光度计吸光度的准确度。,3,、杂散光的检查,测定规定浓度的碘化钠或亚硝酸钠溶液在规定波长处的透光率来进行检查。,（二）仪器校正,一、检测波长的选择,1,、定量分析中，测定波长一般选择在被测组分最大吸收波长处。,2,、如果被测组分有几个最大吸收波长时，可选择不易出现干扰吸收、吸光度较大而且峰顶比较平坦的最大吸收波长。,3,、若干扰物质在最大吸收波长处有较强的吸收，可选用非最大吸收处的波长。,第三节 紫外,-,可见分光光度法分析条件的选择,所选择的溶剂应易于溶解样品而不与样品发生作用，且在测定波长区间内吸收小，不易挥发。,常用溶剂的截止波长,二、溶剂的选择,溶 剂,截止波长（,nm,）,溶 剂,截止波长（,nm,）,水,200,环己烷,200,乙 腈,210,正己烷,220,95%,乙醇,210,二氯甲烷,235,乙 醚,210,三氯甲烷,245,异丙醇,210,四氯化碳,265,正丁醇,210,苯,280,甲 醇,215,丙 酮,330,1,、溶剂参比,当试样组成较为简单，共存组分很少且在测定波长吸收极小，以及显色剂没有吸收，可采用纯溶剂作为参比溶液。,可消除溶剂、吸收池等因素的影响。,三、参比溶液的选择,2,、试剂参比,如果显色剂或其他试剂在测定波长有吸收，按显色反应相同的条件，不加入试样溶液，同样加入试剂和溶剂作为参比溶液。,可消除试剂中组分所产生吸收的影响。,三、参比溶液的选择,3,、试样参比,如果试样基体（除被测组分外的其他共存组分）在测定波长处有吸收，而与显色剂不起显色反应时，可不加显色剂但按与显色反应相同的条件处理试样，作为参比溶液。,适用于试样中有较多的共存组分，加入的显色剂量较少，且显色剂在测定波长无吸收。,三、参比溶液的选择,通过调节待测溶液的浓度和吸收池的厚度来调节A值，使其在0.20.7之间。,四、溶液吸光度的范围及测定,对于不能产生吸收的物质或者吸收系数很小的物质，可选用适当的试剂与被测物质定量反应，生成对紫外或可见光有较大吸收的物质再进行测定。,（一）显色反应要求,（二）显色条件的选择,五、显色反应及显色条件的选择,（一）显色反应要求,1,、被测物质和所生成的有色物质之间必须有确定的计量关系；,2,、反应产物必须有较高的吸光能力（10,3,10,5,）和足够的稳定性；,3,、反应产物的颜色与显色剂的颜色必须有明显的差别；,4,、显色反应必须有较好的选择性，以减免干扰。,1,、显色剂用量,2,、溶液酸碱度,3,、显色时间,4,、温度,5,、溶剂,（二）显色条件的选择,显色剂用量可通过实验选择，在固定金属离子浓度的情况下，作吸光度,A,随显色浓度,c,的变化曲线，选取吸光度恒定时的显色剂用量。,1,、显色剂用量,酸碱度对显色反应影响极大。,如Fe,3+,与水杨酸的配合物，组成随介质pH值的不同而变化。,pH,值范围,络合物组成,颜,色,1.84,Fe(C,7,H,4,O,3,),+,紫红色,47,Fe(C,7,H,4,O,3,),2,-,棕褐色,810 Fe(C,7,H,4,O,3,),3,3-,黄色,合适的pH值可以通过绘制A-pH曲线来确定。,选择平坦处对应,pH,值,2,、溶液酸碱度,由于各种显色反应的速度不同，且介质酸度、显色剂的浓度都将会影响显色时间。,必须固定其他显色条件，通过实验作出A-t曲线，才能确定适宜的显色时间和测定时间。,3,、显色时间,显色反应须在适当温度下进行。,一般的显色反应也可以在室温下进行。,4,、温度,溶液的性质可直接影响被测物质对光的吸收，且显色反应产物的稳定性也与溶剂有关。,苦味酸在水溶液中呈黄色，在三氯甲烷在呈无色。,硫氰酸铁红色配合物在丁醇中比在水溶液中稳定。,5,、溶剂,溶 剂,截止波长（,nm,）,溶 剂,截止波长（,nm,）,水,200,环己烷,200,乙 腈,210,正己烷,220,95%,乙醇,210,二氯甲烷,235,乙 醚,210,三氯甲烷,245,异丙醇,210,四氯化碳,265,正丁醇,210,苯,280,甲 醇,215,丙 酮,330,第四节 紫外,-,可见分光光度法的应用,一、定性分析,二、纯度检查,三、定量分析,四、结构分析,五、应用与示例,利用紫外吸收光谱的形状、吸收峰的数目、各吸收峰的波长和相应的吸收系数等可对部分有机化合物进行定性鉴别。,3.,吸收峰的数目,1.,吸收光谱形状,2.,各吸收峰的波长,4.,相应波长处的吸收系数,一、定性分析,定性分析方法：对比法,1,、,比较吸收光谱的一致性,两个相同化合物，在同一条件下测定其吸收光谱应完全一致。,一、定性分析,例 安宫黄体酮和炔诺酮分子中都存在、-不饱和羰基的特征吸收结构，最大吸收波长相同但相对分子量不同，有明显差异，可用于鉴别。,安宫黄体酮（M386.53）炔诺酮（M=298.43）,max2401nm max2401nm,408,571,2,、比较吸收光谱的特征数据,一、定性分析,3,、,比较吸光度（或吸收系数）比值,有多个吸收峰的化合物，可利用在不同吸收峰（或峰与谷）处测得吸光度的比值A,1,/A,2,或,1,/,2,作为鉴别的依据。,例 中国药典（2015年版）对叶酸采用下述方法鉴别：将检品按规定方法配成10g/ml的溶液，分别测定256nm和365nm处的吸光度，两者比值应为2.83.0。,一、定性分析,二、纯度检查,1,、杂质检查,利用试样与所含杂质在紫外-可见光区吸收的差异。,2,、杂质的限量检测,药物地蒽酚中常有其制备的原料和氧化分解产物二羟基蒽醌。在三氯甲烷溶液中两者的紫外吸收光谱有显著差异，中国药典（2015年版）规定，0.01%的地蒽酚三氯甲烷溶液用1cm吸收池在432nm处测定，吸光度不得大于0.12，即相当于含二羟基蒽醌的含量不大于2.0%。,地蒽酚和二羟基蒽醌的紫外吸收光谱,二、纯度检查,（一）单组分样品的定量分析,（二）多组分样品的定量分析,三、定量分析,1,、单组分样品定量分析的条件,在一个试样中只要测定一种组分，且在选定的测量波长下，试样中其它组分对该组分不干扰。,2,、单组分样品定量分析的方法,（,1,）吸收系数法,（,2,）标准曲线法,（,3,）标准对照法,（一）单组分样品的定量分析,（,1,）吸光系数法,根据,Beer,定律，若,l,和吸收系数,或 已知，即可根据供试品溶液测得的A值求出被测组分的浓度。,（一）单组分样品的定量分析,例 维生素B,12,的水溶液在361nm处的 值是207，盛于1cm吸收池中，测得溶液的吸光度为0.621，则溶液浓度为：,c=0.621/(2071)=0.00300(g/100ml),注意：用 ，则,c,单位为,g/100ml,；用，,则,c,单位为,mol/L,。,（,2,）标准曲线法,先配制一系列不同浓度的标准溶液，以不含被测组分的空白溶液作参比，测定系列标准溶液的吸光度，绘制吸光度,-,浓度曲线，称为标准曲线，进而拟合出回归方程。,在相同的条件下测定试样溶液的吸光度，从标准曲线山找出对应的浓度，或者从回归方程求出被测组分浓度。,（一）单组分样品的定量分析,（,3,）标准对照法,在相同条件下配制标准溶液和供试品溶液，在选定波长处，分别测其吸光度，根据朗伯-比尔定律,因标准溶液和供试品溶液是同种物质、同台仪器及同一波长于厚度相同的吸收池中测定，故,l,和,E,均相等，有,注意：标准对照法应用的前提是方法学考察时制备的标准曲线应过原点。,（一）单组分样品的定量分析,适用条件：若样品中有两种或两种以上的吸光组分共存时，可根据吸收光谱相互重叠的情况分别采用不同的测定方法。,（二）多组分样品的定量分析,2,、根据吸光度加和性原理计算出,b,的浓度,C,b,1,、按单组分的测定法,3,、计算分光光度法,2,、根据吸光度加和性原理计算出,b,的浓度,C,b,部分重叠时，可先在,1,处按单组分测定法测出混合物中,a,的浓度,c,a,，再在,2,处测得混合物的吸光度,A,2,a+b,，根据吸光度的加和性，计算出,b,的浓度,c,b,。,3,、计算分光光度法,常用等吸收双波长消去法。,测定波长的选择需符合以下条件：,(1),干扰组分,b,在这两个波长具有相同的吸光度；,(2),被测组分在这两个波长的吸光度差值足够大。,（一）初步推断官能团,（二）判别顺反异构体,（三）判别互变异构体,四、结构分析,紫外吸收光谱主要取决于分子中的生色团、助色团及它们的共轭情况。,(nm),现象,化合物结构,220,700,无吸收,脂肪烃、脂环烃及衍生物、非共轭烯烃,210,250,强吸收,(lg4),两个共轭单位,200,250,250,290,强吸收,(,lg,=3,4),中强吸收,(,lg,=2,3),苯环存在,300,强吸收,较大的共轭体系,270,350,200,弱吸收,无其它吸收,可能含有羰基,（一）初步推断官能团,在紫外光谱法的应用中，一般来说，顺式异构体的最大吸收波长比反式异构体短且小。,（二）判别顺反异构体,异构体的互变常导致紫外吸收光谱特征参数的变化。,例如，乙酰乙酸乙酯有酮式和烯醇式间的互变异构：,酮式异构体在近紫外光区的,max,为272nm是n,*,跃迁所产生R吸收带。,烯醇式异构体的,max,为243nm，是,*,跃迁共轭体系的K吸收带。,（三）判别互变异构体,1,.,中国药典2015版一部中运用紫外-可见分光光度法对人参总皂苷中人参总皂苷的含量进行测定。,其原理是依据人参皂苷Re虽无共轭结构，紫外光谱中只有末端吸收，但与香草醛高氯酸反应后在可见波长范围内有吸收，故可运用比色法进行定量分析。,2.中国药典2015版第二部中运用了紫外-可见分光光度法对维生素B,12,注射液中维生素B,12,的含量进行了测定。,五、应用与实例,1,、简述导致偏离朗伯,-,比尔定律的原因。,2,、举例说明发色团和助色团，并解释长移和短移。,3,、简述紫外,-,可见分光光度法的主要部件、类型和基本性能。,4,、分光光度法常用的单组分定量分析方法有哪几种？,5,、将下列百分透光率换算成吸光度：,（,1,）,38%,（,2,）,7.85%,（,3,）,55%,（,4,）,0.01%,6,、取,1.000g,钢样溶解于,HNO,3,，其中的,Mn,用,KIO,3,氧化成,KMnO,4,并稀释至,100ml,，用,1.0cm,吸收池在波长,545nm,测得此溶液的吸光度为,0.720,，用,1.6410,-4,mol/L KMnO,4,作为标准，在同样条件下测得的吸光度为,0.360,，计算钢样中,Mn,的百分含量。,复习思考题,7,、某化合物的摩尔吸收系数为,13000L/,（,molcm,），该化合物的水溶液在,1.0cm,吸收池中的吸光度为,0.425,，试计算此溶液的浓度。,8,、某试液用,2.0cm,的吸收池测量时,T=60%,，若用,1.0m,、,3.0cm,和,4.0cm,吸收池测定时，透光率各是多少？,9,、已知石蒜碱的分子量为,287,，用乙醇配制成,0.0075%,的溶液，用,1cm,吸收池在波长,297nm,处，测得,A,值为,0.622,，其摩尔吸收系数是多少？,复习思考题,Thank You!,