第二章食品与基因工程.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Food Biotechnology,食品生物技术,1,目 录,第一章 绪 论,第二章 食品与基因工程,第三章 食品与蛋白质工程,第四章 食品与酶工程,第五章 食品与发酵工程,第六章 食品与细胞工程,第七章 食品生物工程中的下游过程,第八章 食品生物技术与食品安全检测,第九章 生物技术与食品工业“三废”治理,2,第一节 概 述,第二节 工具酶,第三节 目的基因制备,第四节 基因载体,第五节 基因重组,第六节 转化、增殖和表达,第七节 基因工程在食品工业中的应用,第八节 后基因组学及其应用研究,第二章 食品与基因工程,3,第一节 概 述,一、基因工程的诞生,1973,年,S.N.Cohen,等在美国科学院学报（,PNAS,）上发表了题为“,Construction of Biological Functional Bacterial Plasmid in Vitro”,，阐明了体外构建的细菌质粒能够在细胞中进行表达，标志着基因工程的诞生。,4,二、基因工程涵义、特点及其操作步骤,基因工程,（,gene engineering,）,又称为分子克隆（,molecular cloning,）或重组,DNA,技术（,recombinant DNA Technology,），其涵义为：用酶学方法，将异源基因与载体,DNA,在体外进行重组，将形成的重组子,DNA,导入宿体细胞，使异源基因在宿体细胞中复制表达，从而达到改造生物品种或性状，大量生产出人类所需要生物品种和产物。,5,图,2-1,基因工程操作过程示意图,2,6,7,三、基因工程的发展,1977,年英国分子生物学家,F.Sanger,发明了快速,DNA,测序技术并首先完成的全长,5387bp,的,174,噬菌体基因组全序列的测定。,1982,年第一个由基因工程菌生产的药物胰岛素已在美国和英国获准使用。,1983,年第一个转基因植物培育成功，,1992,年第一个转基因玉米及转基因小麦植株诞生，,1994,年转基因番茄上市。,1996,年完成了酵母基因组,DNA,（,125105bp,）的全序列测定。,2003,年,人类基因组计划,经过,20,多年努力已宣布草图描绘成功。为后基因组时代的诞生拉开了序幕。,8,第二节 工具酶,在基因工程中应用的酶统称为工具酶（,enzyme of tools,）。,(,一,),、限制性内切酶种类,限制性内切酶有三种类型：,I,型酶、,II,型酶和,III,型酶。,II,型酶分子量较小，大约,20-100kD,，是一种简单的单功能酶，作用时无需辅助因子或只需,Mg2+,，能识别双链,DNA,上特异的核苷酸序列，同时专一性强，而且其识别序列与切割序列相一致。这类酶特别适合于基因工程操作。,(,二,),、限制性内切酶命名,1973,年，,H.O.Smith,和,Nathaus,提出限制性内切酶的命名原则,一、限制性内切酶,限制性内切酶（,restriction,endonuclease,简称,RE,）是一类专一性很强的核酸内切酶,9,(,三,),、限制性内切酶的作用机制和作用方式,如图,2-2,所示,图,2-2,限制性核酸内切酶作用机制,其作用方式及识别位点有如下几种：,1.,识别不同的特异核苷酸序列,EcoR,I,识别,Hae,I,识别,10,Asu,I,识别,EcoR,II,识别,Mbo,I,识别,注：表示切割,5-,磷酸二酯键位置。,2.,识别序列皆具有回文结构,3.,切割后形成各种粘性末端或平整末端，按其切割双链的方式可分两种：粘性末端和平整末端。,限制性内切酶错位切割,DNA,双链而形成彼此互补的单链末端，称为粘性末端（,Cohesion ends,）。,11,另一种是在同一位点平齐切割,DNA,两条链而形成的双链末端，称为平整末端（,Flush ends,）。如,Alu,I,的识别序列为：,4.,切割后形成异源二聚体,(,四,),、限制性内切酶识别序列及反应系统,限制性核酸内切酶在双链,DNA,上能够识别的特殊核苷酸序列称为,识别序列,。,稀切酶（,rare,cuting,enzymes,），如表,2-1,所示，同裂酶（,isoschizomer,）如表,2-2,所示。同尾酶（,isocaudamer,），如表,2-3,所示。,12,表,2-1,部分限制性内切稀切酶,2,稀切酶,切,割,位,点,数,识别序列,Ad2,SV40,X174,M13mp7,PBr322,T7,TPA,A.D,Fse,I,GGCCGGCC,O,3,0,0,0,0,0,0,1,Not,I,GCGGCCGC,0,7,0,0,0,0,0,0,0,Rsr,II,CGGWCCG,5,2,0,0,0,0,1,1,0,Sfi,I,GGCCN,5,CCGG,0,3,1,0,0,0,1,1,2,Sgr,I,CrCCGGyG,7,6,0,0,0,1,0,0,0,Swa,I,ATTT/AAAT,0,1,1,0,1,0,1,0,1,表,2-2,具有相同切割位点的同裂酶,限制性核酸内切酶,识别序列及切割位点,限制性核酸内切酶,识别序列及切割位点,Aat,I,，,Stu,I,A,AGG/CCT,Bam,HI,，,Bst,I,G/GATCC,Acc,II,，,Fnu,DII,，,Mun,I,，,Tha,I,CG/CG,Bbn,III,，,Cla,I,Bbu,I,，,Sph,I,AT/CGAT,GCATG/C,Acc,III,，,Bsp,II,，,Mro,I,T/CCGGA,Bbr,PI,，,Pma,CI,CAC/GTG,Acy,I,，,Aha,II,，,Ans,II,，,Bbi,II,Gr/CgyC,Bcn,I,，,Nci,I,Bsp,RI,，,Hae,III,，,Pa,tI,CC/,sGG,GG/CC,Afl,I,，,Aua,II,，,Eco,471,G/,GwCC,Bst,YI,，,Mfl,I,，,Xho,II,R/,GATCy,Afl,II,，,Bfr,I,C/AATTG,Ccr,I,，,Pae,R71,，,Xho,I,，,Sex,I,C/TCGAG,Aha,III,，,Dra,I,TTT/AAA,Cel,II,，,Esp,I,GC/,TnAGC,Aoc,I,，,Bsu,361,，,Crn,l,Ec,o,811,CC/,TnAGG,Cfo,I,，,Hha,I,Cfr,I,，,Eae,I,GCG/C,Y/,GGCCr,13,Aoc,II,，,Bmy,I,，,Bsp,1286,，,Nsp,II,，,Sdu,I,GdGCh,/C,Dar,II,，,Eco,O1091,Eag,I,，,Ecl,XI,，,Eco,521,rG/GnnCCy,C/GGCCG,Aos,I,，,Aui,II,，,Psp,I,TGC/GCA,EcoT,141,，,Sty,I,C/,CwwGG,ApaL,I,，,Sno,I,G/TGCAC,Eco,VIII,，,Hind,III,A/AGCTT,Apy,I,，,BstN,I,，,Mva,I,CC/,wGG,Hap,II,，,Hpa,II,，,Msp,I,C/CGG,Aqu,I,，,Ava,I,，,Avr,I,，,Nsp,III,C/,yCrG,Hinc,II,，,Hind,II,Gty/rAC,Ase,I,，,Asn,I,AT/TAAT,KsP,I,，,Sac,II,，,Sst,II,CCGC/GG,Asp,7001,，,Xmn,I,GAAnn/nnTTC,Nsp,HI,，,NsP,I,rCAtG/y,Asp,HI,，,Hgi,AI,GwGCw,/G,Pvu,I,，,Xor,II,CGAT/CG,Asp,I,，,Tth,111,GACn/nnGTC,Sac,I,，,Sst,I,GAGCT/C,Asp,I,，,Cfr,131,，,Nsp,IV,，,Sau,961,G/,GnCC,Taq,I,，,TthHB,81,Xam,I,，,Xcy,I,T/CGA,C/CCGGG,Asu,II,，,BstB,I,，,Nsp,V,，,Sfu,I,TT/CGAA,表,2-3,部分限制性核酸内切同尾酶,2,黏性末端,限,制,性,核,酸,内,切,酶,5CATG,Afl,III,，,Dsa,I,，,Nco,I,，,Sty,I,，,Bsp,HI,5GATC,Sau,3A,，,Nde,II,，,Bgl,II,，,Xho,II,，,Bam,HI,，,Mle,I,，,Bel,I,5GGCC,EclX,I,，,Eae,I,5CGCG,Mlu,I,，,Afl,III,，,Bss,HII,，,Dsa,I,5CCGG,Cfr,10,，,Age,I,，,Xma,I,，,Ava,I,，,Mor,I,5TCGA,Sae,I,，,Xho,I,，,Ava,I,5GTAC,Sap,718,，,Ban,I,，,Sph,I,5CTAG,Spe,I,，,Nhe,I,，,Avr,II,，,Sty,I,，,Xba,I,5CG,Mae,I,，,Acy,I,，,Hin,PI,，,Nar,I,，,Hpa,II,，,Msp,I,，,Taq,I,，,Cla,I,，,Acc,I,，,Sfu,I,5TA,Nde,I,，,Mae,I,，,Mse,I,，,Asn,I,CATG3,Nla,III,，,Nsp,I,，,Sph,I,AGCT3,Sac,I,，,Ban,II,，,Bmy,I,GGCC3,Apa,I,，,Ban,II,，,Bmy,I,，,Asp,HI,TGCA3,Nsi,I,，,Asp,HI,，,Bmy,I,，,Pst,I,GCGC3,Hae,II,，,Bbe,I,14,二、基因工程操作中的其他酶,（一）、,DNA,连接酶,（二）、,DNA,聚合酶,I,（三）、碱性磷酸酯酶,（四）、,T4,多聚核核苷酸激酶,（五）、,S1,核酸酶,（六）、反向转录酶,15,酶,主要用途,限制性内切核酸酶,识别,DNA,特定序列，切断,DNA,链；分析染色体结构、制作,DNA,的限制酶图谱、测定较长,DNA,序列以及基因的分离、基因的体外重组等。,DNA,聚合酶,或其大片段（,Klenow,）,缺口平移制作标记,DNA,探针,合成,cDNA,的第二链,填补双链,DNA3,凹端,DNA,序列分析,耐热,DNA,聚合酶（,Taq,DNA,聚合酶等）,聚合酶链反应（,PCR,）,DNA,连接酶,连接两个,DNA,分子或片段,多核苷酸激酶,催化多核苷酸,5,羟基末端磷酸化，制备末端标记探针,末端转移酶,在,3,末端加入同质多聚物尾,SI,核酸酶，绿豆核酸酶,降解单链,DNA,或,RNA,，使双链,DNA,突出端变为平端,DNA,端酶,降解,DNA,，在双链,DNA,上产生随机切口,RNA,酶,A,降解除,RNA,磷酸酶,切除核酸末端磷酸基,表,1 DNA,重组技术中最常用的工具酶,16,第三节 目的基因制备,原核生物基因的分离多采用前法，而真核细胞基因的分离则采用后两种方法。,一、生物学方法,原核生物中常用鸟枪射击法或滔弹散射法（,shotgun cloning,）来克隆分离基因。此法优点是：快速简便、产物纯度高，是真正的天然基因，兼有外显子和内含子。,缺点是工作量大，具有一定的盲目性。,另一种生物学方法是采用分子杂交手段。,1973,年,，,Shin,和,Martin,用分子杂交技术分离目的基因获得成功。,17,二、化学合成法,化学合成一个循环有如下,4,个步骤：,脱保护作用；偶联反应；封闭反应；氧化反应。,整个合成反应历程如图,2-3,表示。,图,2-3,固定化亚磷酸三酯法合成寡聚核苷酸,18,三、基因文库法,基因文库（,gene library,）或称为,DNA,文库，它是指用克隆方法将一种生物全部基因组以重组体的方式长期保持在适当的宿主中。当需要重组体,DNA,某一片段时，便可以在此文库中查找。基因文库又称为,cDNA,文库,34,。,cDNA,文库构建的步骤：,1.,酶促合成法制取,cDNA,2.,从组织或细胞中制备总,RNA,和,mRNA,3.,合成,cDNA,第一条链,19,其反应过程为图,2-5,的所示。,图,2-5,合成,cDNA,第一链反应过程,20,4.,cDNA,第二条链的合成，其反应历程如图,2-6,所示。,图,2-6,置换法合成,cDNA,反应过程,21,5.,双链,cDNA,与载体,DNA,的连接,构建,cDNA,文库并进行目的基因,cDNA,克隆的筛选、鉴定等试验。,22,四、,PCR,扩增法,1985,年，美国,Cetus,公司的,Mullis,等人开发成功的聚合酶链式反应（,Polymerase chain reaction,，,PCR,）技术，这一快速地扩增特异,DNA,片段系统在分子生物学领域中是一项重大的革新。,其反应历程如图,2-7,所示。,图,2-7 PCR,扩增技术基本原理,23,PCR,是由美国科学家,Kary,B.Mullis,提出的一种体外简化条件下模拟,DNA,体内复制的快速扩增的方法，,1993,年获得诺贝尔化学奖。,Kary,B.Mullis,24,Kary,B.Mullis,（,1944,）,,25,PCR,的原理,：,体外,DNA,复制。,包括,高温变性,、,低温退火,和,中温延伸,过程。,26,PCR,扩增产物呈指数增长,27,PCR,反应循环,55,退火,94,变性,72,延伸,PCR,循环,28,PCR,扩增仪,29,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,标准的,PCR,反应体系,4,种,dNTP,混合物 各,200umol/L,引物 各,10,100pmol,模板,DNA,0,.,1,2ug,Taq,DNA,聚合酶,2,.,5u,/50,l,Mg,2+,1,.,5mmol/L,30,1,2,3,4,5,22,55,72,94,时间（,min,）,温度,（,）,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,适温延伸,3,高温变性,1,低温退火,2,重复,1,3,步,25,30,轮,目的,DNA,片段,扩增,100,万倍以上,DNA,双螺旋,DNA,单链,与引物复性,DNA,变性,形成,2,条单链,子链延伸,DNA,加倍,31,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,1,2,3,4,5,22,55,72,94,时间（,min,）,温度,（,）,适温延伸,3,高温变性,1,低温退火,2,重复,1,3,步,25,30,轮,目的,DNA,片段,扩增,100,万倍以上,DNA,双螺旋,DNA,单链,与引物复性,子链延伸,DNA,加倍,DNA,变性,形成,2,条单链,模板,DNA,95,32,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,95,50,引物,1,引物,2,DNA,引物,33,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,50,引物,1,引物,2,DNA,引物,72,Taq,酶,Taq,酶,34,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,72,第,1,轮结束,95,第,2,轮开始,35,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,95,50,72,Taq,Taq,Taq,Taq,36,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,72,第,2,轮结束,37,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,模板,DNA,第,1,轮扩增,第,2,轮扩增,第,3,轮扩增,第,4,轮扩增,第,5,轮扩增,第,6,轮扩增,38,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,灵敏度高,皮克,(pg=10,-12,),量级扩增到微克,(,ug,=10,-6,),水平,能从,100,万个细胞中检出一个靶细胞,病毒检测的灵敏度可达,3,个,RFU,细菌检测的最小检出率为,3,个细菌,简便、快速,一次性加好反应液，,2,4,小时完成扩增,扩增产物一般用电泳分析,对标本的纯度要求低,血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提,DNA,39,引物设计,：,（,1),序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。,（,2,）引物长度以,15-40,bp,为宜。,（,3,）,碱基尽可能随机分布,，,G+C,占,50-60%,。,（4）引物内部避免形成二级结构。,（5）两引物间避免有互补序列。,（6）引物3,端为关键碱基；,5,端,无严格限制。,40,3,5,3,5,限制性内切酶的识别序列,启动子序列,定点突变,探针标记,41,1,）,PCR,反应成分,（,1,）模板,单、双链,DNA,均可。,不能混有蛋白酶、核酸酶、,DNA,聚合酶抑制剂、,DNA,结合蛋白类。,一般,100ng DNA,模板,/100,L,。,模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。,PCR,反应条件,42,（,2,）引物浓度,0.1-0.5 mol/L,浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。,（,3,）,Taq,DNA,聚合酶（,thermus,aquaticus,),0.5-2.5 U/50,l,酶量增加使反应特异性下降,;,酶量过少影响反应产量。,43,（,4,）,dNTP,dNTP,浓度取决于扩增片段的长度,四种,dNTP,浓度应相等,浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量,dNTP,可与,Mg,2+,结合，使游离的,Mg,2+,浓度下降，影响,DNA,聚合酶的活性。,44,（,5,）,Mg,2+,Mg,2+,是,DNA,聚合酶的激活剂。,0.5mmol/L-2.5mmol/L,反应体系。,Mg,2+,浓度过低会使,Taq,酶活性丧失、,PCR,产量下降；,Mg,2+,过高影响反应特异性。,Mg,2+,可与负离子结合，所以反应体系中,dNTP,、,EDTA,等的浓度影响反应中游离的,Mg,2+,浓度。,45,2,）循环参数,变性,使双链,DNA,解链为单链,95,o,C 20-30,秒,(2),退火,温度由引物长度和,GC,含量决定。,增加温度能减少引物与模板的非特异性结合,;,降低温度可增加反应的灵敏性。,46,（,3,）延伸,70-75,o,C,，,延伸时间由扩增片段长度决定,（,4,）循环次数,主要取决于模版,DNA,的浓度,一般为,25-35,次,次数过多：扩增效率降低,错误掺入率增加,47,PCR,的类型和应用,研究,基因克隆，,DNA,测序，分析突变,诊断,细菌、病毒、寄生虫检测，诊断,人类基因组工程,遗传图谱的构建，,DNA,测序，表达图谱,法医,犯罪现场标本分析,肿瘤,各种肿瘤检测,其他,48,第四节 基因载体,目前，在基因工程中应用的基因载体主要是,质粒、病毒,和,噬菌体,，它们都能担当无性繁殖载体。因为它们均符合作为载体应具备的下列条件：,（,1,）本身是一个复制子，能自我复制,（,2,）相对分子质量较小,（,3,）能给宿主细胞（受体细胞）提供可选择标记,（,4,）只有单一限制性内切酶切点,49,一、质 粒,质粒（,plasmid,）存在于细菌、放线菌及酵母细胞内细胞质中双螺旋共价闭环的,DNA,（,covalently,closed,and circular DNA,缩写为,cccDNA,）。它能进行独立复制并保持恒定遗传的复制子。,50,1.,质粒的生物学特性,质粒,(plasmid),：是指细菌等生物细胞内一类,独立于染色体外而能自我复制的遗传物质,，一般为双链,(double strand,，,ds,),的共价闭合环状,DNA(covalently,closed,circularDNA,，,cccDNA,).,质粒依赖于宿主编码的酶和蛋白质进行复制和转录，是宿主的共生物,51,质粒的,不亲和性,(plasmid incompatibility),，也称,不相容性,，是指在没有选择压力的情况下，,两种亲缘关系密切,的,不同质粒,不能在同一,宿主细胞中稳定共存的现象,彼此不相容的质粒属于,同一个不亲和群,(incompatibility group),，而彼此能够共存的亲和质粒则属于,不同的不亲和群,52,2.,质粒载体的条件及选择,质粒克隆载体,是指能将外源基因携带至宿主细胞并可在其中自主复制的质粒,DNA,理想的质粒克隆载体一般具备以下条件：,分子结构中具有多个单一限制酶切位点，具有易被检测的选择标记基因，且切点位于选择标记基因上；能插入、运载一定大小的外源基因；在宿主细胞内能自主复制；在与外源基因构建重组质粒后具有转化功能；分子量小，易于操作，一般为松弛型复制控制；容易控制，安全可靠。,53,3.,质粒载体例解,（,1,）质粒载体,pBR322,pBR322,是目前应用最广泛的人工构建的载体之一。如图,2-8,所示。用小写英文字母,P,代表质粒，,BR,表示该质粒 研究者,Bolivar,和,Rogigerus,，而,322,是具体研究编号。,pBR322,大小为,4363bp,，（,1bp=1,碱基对）含有,2,个抗生素抗性基因。,54,pBR322,质粒的优点,：,（,1,）,pBR322,质粒分子质量较小,（,2,）,pBR322,质粒拷贝数高,（,3,）,pBR322,质粒具有抗生素抗性基因,55,pBR322,的结构,56,pBR322,质粒具有抗菌素抗性基因，构建的,pBR325,、,pBR327,如图,2-9,、图,2-10,所示。,图,2-9 pBR325,衍生质粒 图,2-10 pBR327,衍生质粒,57,（,2,）,Bluescript,Ml3+,、,Bluescript,Ml3-,：是一对带有,M,13,噬菌体,DNA,复制起点,ori,的质粒载体。这对载体可在体内或在体外产生互补于插入到其多克隆位点的外源双链,DNA,中任一条链的单链,DNA,或,RNA,。,58,（,3,）质粒载体,PUC,pUC,质粒是在,pBR322,的基础上，在,5,-,未端加入一段多克隆位点（,multiple cloning,sites,MCS,）的,-,半乳糖糖苷酶的,-,肽基因,LacZ,基因。,59,二、噬菌体载体,1.,噬菌体的生物学特性,噬菌体,(,bacteriophage,),是一类,细菌病毒,的总称。,噬菌体颗粒的外壳是,蛋白质,，内部是,核酸,噬菌体的,感染效率极高,。,60,噬菌体的生命周期可分为,溶菌周期,和,溶原周期,溶菌周期,是指噬菌体吸附到宿主细胞表面后注入,DNA,，经过,DNA,复制及蛋白质合成，组装成,子代噬菌体颗粒,，最后使宿主细胞破裂，释放出子代噬菌体颗粒的生长周期,溶原周期,是指噬菌体在感染过程中,不产生,子代噬菌体颗粒，而将噬菌体,DNA,整合到宿主细胞染色体,DNA,中；成为其组成部分的生长周期,只具有溶菌周期的噬菌体被称为,烈性噬菌体。,具有溶原周期的噬菌体被称为,温和噬菌体,。,61,具有一套,噬菌体完整基因组,的细菌被称为,溶原性细菌,(,lysogen,),。以温和噬菌体感染细菌培养物使之形成溶原性细菌的过程被称为,溶原化,(,lysogenization,),。,整合的噬菌体,DNA,是指插入宿主细胞染色体,DNA,中的噬菌体,DNA,；而以质粒,DNA,分子形式存在的噬菌体,DNA,被称为,非整合的噬菌体,DNA,。,62,噬菌体的侵染循环,63,2.,噬菌体载体,噬菌体是,大肠杆菌的噬菌体,，它由,外壳蛋白,和,DNA,组成，,噬菌体颗粒由,头,与,尾,两部分组成。头部装载了其整个基因组,DNA,。,DNA,为一长度约,48.5kb,的线状双链,DNA,分子，可以分为三个区段：左臂、中央区和右臂。在左臂和右臂的,5,处各有一,12,个碱基长的互补单链,(,从而构成黏性末端,),。,64,DNA,噬菌体载体的优点,:,可携带较长的外源,DNA,片段。,重组后的,DNA,分子可在体外被包装成噬菌体颗粒。与用,DNA,直接转染细菌相比，包装成的噬菌体颗粒具有更强的感染宿主细胞的能力。,重组的噬菌体容易筛选和贮存。,噬菌体载体的分类,:,一般可将入噬菌体载体分为,插入型载体,和,置换型载体,。,65,插入型载体,(insertion vector),，是指在基因组的非必要基因区内有一种或不止一种限制酶的单一酶切位点可供外源,DNA,插入，而不缺失其本身任何片段的,噬菌体载体,置换型,(,取代型,),载体,(replacement vector),，是指在基因组的非必要基因区内两个或两个以上的限制酶切位点间的,DNA,区段可被插入的外源,DNA,片段所置换的,噬菌体载体,66,3.M13,噬菌体载体家族,M13,噬菌体的侵染循环,M13,噬菌体的侵染循环,67,M13,噬菌体的特性,M13,是,丝状噬菌体,，含有长度为,6407,个核苷酸的,闭合环状单链,DNA,基因组,。当,M13,感染宿主大肠杆菌细胞时，侵入的单链噬菌体,DNA,转变为,双链复制型,(RF),。,双链复制型在复制时产生大量的,单链,DNA,。单链,DNA,再被外壳蛋白包装为,成熟的噬菌体颗粒,。,在宿主大肠杆菌细胞生长过程中，子代噬菌体颗粒被释放出来。,68,M,13,噬菌体载体的优点,A.,由于,M,13,单链,DNA,的复制型呈双链环形，因此，此时的,DNA,可同质粒,DNA,一样进行提取和体外操作；,B.,不论是双链的还是单链的,M,13,DNA,均能感染宿主细胞，产生噬菌斑或形成侵染菌落；,C.,由于,M,13,是丝状噬菌体，其长度不受外壳蛋白包装的限制，因此根据重组,DNA,的长度，被包装成的噬菌体颗粒可大可小。,69,三、动物载体,DNA,病毒,是外源,DNA,导入哺乳动物细胞的理想载体。其中，常用的载体由,野生型猿猴空泡病毒,40(SV40),基因组,DNA,等改建而成,。,SV40,病毒,：猿猴空泡病毒,40(simian,vacuolating,virus 40),，即,SV40,病毒，是一种小型,20,面体的颗粒，外壳由,VPl,、,VP2,和,VP3,三种病毒蛋白构成，中间包装着长,5.2kb,的环状基因组,DNA,。,SV40,基因组,DNA,分为早期和晚期两大区域。早期区在溶原生长中一直表达，而晚期区仅在,DNA,复制后的一段时间中表达，产生病毒外壳结构蛋白。早期区与晚期区之间则为复制起点。,70,第五节 基因重组,基因重组,即将目的基因（或外源基因）与载体在体外结合构建形成重组子。,图,2-11 DNA,体外重组方式,71,第六节 转化、增殖和表达,一、转化,1,、宿主细胞,宿主细胞,是指在转化、转导、杂交中接受外源基因的细胞。,常见的宿主细胞以细菌为主，此外，还有放线菌、酵母菌和哺乳动物细胞。其中微生物受体系统主要有大肠杆菌、枯草杆菌、放线菌和酵母等。应用实例见,P3031,。,72,第六节 转化、增殖和表达,2,、感受态,感受态,是指宿主细胞能吸收外源,DNA,分子而有效地作为转化受体的某些生理状态。,一般宿主细胞在对数生长期转化能力最强。转化效率的高低除了取决于受体细胞的这种生理状态化，还与重组,DNA,分子的构型和分子的大小有关。环状,DNA,分子的相对分子质量越大，其转化率越低。,73,第六节 转化、增殖和表达,3,、扩增检筛,转化后的菌落通常置于含有标记抗菌素的丰富培养基上进行扩增、初筛，然后再用标记的,mRNA,进行原位杂交、电泳等方法检测筛出带有目的基因的转化子。应用实例见,P31,。,74,第六节 转化、增殖和表达,R.K.Saiki,和,K.B.Mullis,分别于,1985,年和,1987,年发展了一种“多聚酶链反应（,polymerase chain,reaction,PCR,）”。,PCR,技术,最大特点,是能高效扩增，能专一富集一个特异性,DNA,序列，可以成,10,6,倍扩增。,PCR,技术操作步骤为：反复将目的基因片段进行热变性处理，令其双股链解开；进行反链杂交、退火、形成单链；用,Taq,DNA,多聚酶沿,DNA,链全程全成出两股双链,DNA,分子；然后开始第二个反应周期。,75,二、基因表达,克隆,DNA,的最终目的是表达最终目的产物。因此，通过,DNA,重组技术使特定基因片段在受体细胞内大量增殖，拷贝数目大大增加，就必须使特定基因进一步转录、翻译为相应的蛋白质（或酶），进而获得它们的代谢产物，这一过程,称,为基因表达。,76,第七节 基因工程在食品工业中的应用,我国,转基因食品卫生管理办法,中把,转基因食品,定义为：利用基因工程技术改变基因组构成的动物、植物和微生物生产的食品和食品添加剂。,按转基因的功能分为,6,大类：增产型、控熟型、高营养型、保健型、新品种型和加工型。,按食品原料种类分为,3,大类：转基因微生物食品、转基因植物食品和转基因动物食品。,77,一、转基因微生物食品,转基因微生物菌株则称为工程菌（,engineering strain,）。,面包酵母；,啤酒酵母；,凝乳蛋白酶生产菌；,一些基因工程菌生产香精、色素、氨基酸、维生素等。,78,（一）,应用于提高食品产品的品质,第一个采用基因工程改造的食品微生物为,面包酵母,（,saccharomyces,cerevisiae,）。,1991,年，英国政府批准通过了,DNA,重组面包酵母工程菌的商业化应用,7,。在啤酒酿造中,乙酰乳酸通过自发氧化作用形成双乙酰，双乙酰形成机理及其基因重组控制双乙酰如图,2-12,、图,2-13,所示。,图,2-12,啤酒酿造中双乙酰形成机理,图,2-13,啤酒酵母导入,-,乙酰乳酸脱羧酶基因后双乙酰酶促转化,79,（二）应用于简化工艺，缩短生产周期,采用基因工程技术将大麦中,-,淀粉酶,基因转入酿酒酵母中进行发酵生产，可大大缩短啤酒生产工艺，节省能源，推动啤酒生产革新。,近年来，在一个啤酒酵母菌株中表达了一个内源性的,PGUI,基因，结果发现这个重组菌株能够分泌有活性的,内源性聚半乳糖酸酶,，可以大大缩短葡萄酒的过滤时间。,80,在过去,20,多年中，,乳酸乳球菌,（,Lactococcus,lactis,）一直是,DNA,重组技术中一个主要研究对象，与之相关的多种技术正相继被开发和研制出来，其中包括乳酸乳球菌的遗传转化、导入和表达（外源的）,DNA,分子以及分泌蛋白质等。,有些乳酸菌除了产生其主要代谢产物外，还能够产生其他大量的抑制性物质如细菌素、双乙酰、,CO,2,和,H,2,O,2,等化合物。利用基因重组技术构建可以产生多种细菌素的菌株，将进一步扩大这类物质在食品防腐中的作用。,具有噬菌体防卫系统、细菌素产生能力、抗性或免疫基因选择标记等菌株已经被构建，已成功地应用在奶酪生产上。,（三）应用于食品的抗菌和防腐保鲜,81,现将工程菌在食品工业应用较多的菌株如列表,2-4,所示。,工程菌名称,改造的方式,用,途,Lactobacillus,修饰细菌素合成,乳制品生产、无污染物质生产,Lactococcus,修饰蛋白酶活性,乳制品生产加速干酪熟化,避免噬菌体感染,提高菌种稳定性,修饰溶菌酶合成,干酪生产，预防杂菌感染,表,2-4,基因工程改良的微生物工程菌,Saccharomyces,葡聚糖酶基因导修啤酒酵母中表达,啤酒生产，缩短发酵时间,Cerevisiae,饰豌豆脂肪氧化酶,增强面团流变学物性及稳定性,Saccharomyces,Carlsbergensis,修饰来自,Enterobacter,aerogenes,或,Aceto-bacter,pasteurianus,的,a-,乙酸乳酸脱羧酶基因,缩短酿造周期,修饰来自,Aspergieeus,niger,的葡萄糖淀粉酶基因,应用于淀粉降解和低热量啤酒的生产,修饰来自,Schwanniomyces,occidentalis,的淀粉酶和葡萄糖淀粉酶,应用于淀粉酒精和低热量啤酒的生产,葡聚糖酶,应用于葡聚糖降解和啤酒过滤澄清,Saccharomyces,Cerevisiae,-1,4-,葡聚糖酶基因导入葡萄酒酵母中表达,增加酿制酒的果香味,萜类化合物形成,82,许多食品生产中所应用的食品添加剂或加工助剂，如氨基酸、维生素、增稠剂、有机酸、乳化剂、表面活性剂、食用色素、食用香精及调味料等，都可以采用基因工程菌发酵生产而制得。因此，基因工程对微生物菌种改良大有可为。,83,（四）应用于食品级酶制剂生产菌的改良,现将,NovoNordisk,、,Gist-Brocades,等公司采用基因工程改良霉菌种列于表,2-5,、表,2-6,、表,2-7,。,凝乳酶（,chymosin,）是,第一个,应用基因工程技术把小牛胃中的凝乳酶基因转移至细菌或真核微生物生产的一种酶。,耐热,-,淀粉酶,糖化酶,葡萄糖异构酶,-,环状糊精葡基转移酶,植酸酶,SOD,84,表,2-5,丹麦,Novo,Nordisk,公司利用基因工程改良产酶微生物菌种,12,85,86,（五）应用于生产保健食品的有效成分,现在，可以采用转基因手段，在动、植物或其细胞中，得到基因表达而制造有益于人类健康的保健成分或有效因子。,采用基因重组构建菌株高表达的单链蛋白,2.5-DKG,还原酶，以加速催化生成,维生素,C,的前体,2-KLG,，便可有效地缩短生产维生素,C,的生产周期。,超氧化物歧化酶（,SOD,）,能有效消除氧自由基，,Brehm,等人将,BStearothermophilus,的,Mn,-SOD,基因克隆入大肠杆菌中，其重组体,Mn,-SOD,在大肠杆菌高效达，产生的,SOD,占可溶性蛋白,49%,。,采用基因重组技术克隆破囊壶菌（,Thraustochy,triumroseum,）,DHA,合成关键酶基因，进而在酵母真核细胞中表达。,Anammartet14,克隆了毕氏酵母,9,脂肪酸脱饱和酶基因及其调节机制。,87,（六）应用于食品微生物快速检测,随着,DNA,分子检测技术和,PCR,等技术的应用，可使沙门氏菌、李斯特氏菌、致泻性,E.coli,等食源性微生物的检测已发展到一个新水平。,88,二、转基因动物食品,转基因动物食品,是由转基因动物产生的食物或利用转基因动物为原料生产的食品或食品添加剂。,1985,年，第一例转基因家畜研制成功由于转基因家禽及其生产的食品是人类较直接的食物，基因重组技术改进牛奶成分如表,2-8,所示。,目前科学家们已经成功培育了各种转基因动物如,转基因牛、转基因羊、转基因猪、转基因鸡、转基因鱼,等，设计的性状有：,高生长速度、高产奶率、高产蛋率、瘦肉型化、抗冻、抗病以及生产药用蛋白等。,89,表,2-8,基因重组技术改进牛奶成分,18,90,三、转基因植物食品,所谓,转基因植物食品,是指由转基因植物产生的食物或利用转基因植物为原料生产的食品或食品添加剂。,1983,年，世界上第一例转基因植物即转抗虫基因的烟草问世。,1994,年美国,FDA,批准延熟保鲜的转基因番茄上市。,目前，已有百余种植物相继被转基因，转基因植物食品资源已成为食品工业中一支不可忽视的新生力量。在转基因作物种植的面积居世界首位（占,72,）的美国，消费的,50,的大豆和,30,以上的玉米来自转基因植物，生产的,4000,多种食品含有转基因成分。,我国转基因耐储存番茄,“,华番一号”和转基因抗虫棉于,1997,年进入商品化生产。,91,至目前为上，在欧洲根据相关法规（,90/220EEC,）已有,10,多种转基因植物（作物）被批准上市，如表,2-9,所示。在世界上有,23,个作物品系已准许进行种植和饲料使用，延迟成熟番茄（表,2-10,）以及改变脂肪含量的转基因作物（如表,2-11,）也已在某些国家准予种植。,表,2-9,欧洲获准上市的转基因作物及其产品,18,92,表,2-10,世界各地种植的延迟成熟番茄及其产品,18,注