抗药性监测.ppt

,*,抗 药 性 监 测,甘肃省疾病预防控制中心,丁小全,抗药性是影响全球公共卫生、农业、林业、畜牧业等领域中有害生物控制的重要问题，是影响媒介生物性传染病疾病预防控制的关键因素。抗药性的产生和发展与药剂的使用有非常密切的关系。开展和加强重要病媒生物抗药性监测，可以指导化学药剂的合理使用，提高控制效果，延缓抗药性发展速度，减少人畜中毒事件的发生，保护有益生物，维持生态平衡。,主 要 内 容,第一部分,：,抗药性概况及基本知识,一、背景,二、抗药性的基本概念,三、害虫对杀虫剂产生抗药性的机制,四、影响抗性发展的因素,第二部分：抗药性监测方法,第三部分：抗性治理,第四部分：全国重要病媒生物抗药性监测（试行）方案,第一部分 抗药性的基本知识,一、背景,抗药性监测在疾病预防控制中的重要性,抗药性概况,抗药性监测的基础条件,疫情控制的需要,人民生活和社会与经济的需要,当前抗药性监测中存在的问题,专业技术人员缺乏,测定方法不统一,抗药性监测结果的利用率低,抗药性：某一昆虫的一个品系中，形成了对某一剂量毒物的耐受能力，而这一剂量对同种正常种群的大多数仍然是敏感的为抗药性。,交互抗性：是指一种害虫对某种药剂产生抗药性后，对其它化学结构类似或具有相同作用机制的农药品种，虽然不曾使用过也产生抗性。,二、抗药性的基本概念和特点,负交互抗性：一种昆虫对某一药剂产生抗性后，对另一种药剂的敏感性增强。,多抗性：一种害虫体内存在一种或多种不同的抗性基因或抗性等位基因，能对几种不同作用机制的农药同时产生抗性。,耐药性：有些昆虫对某些杀虫药剂表现出先天性的抗药能力，或昆虫的某些发育时期或某些生理状态下对药剂的敏感性降低，称为耐药性。,抗药性的特点,抗药性是一个种群特征：,普遍,性：,杀虫剂普遍有抗性产生,广泛性：全球现象，分布很广,区域性：抗性发展程度的高低与当地的药剂选择压力 是正相关。抗药性的发展过程是月点面片。,遗传性,卫生害虫更易产生抗药性,害虫对新的杀虫剂抗性的产生有加快的趋势,三、昆虫对杀虫剂产生抗药性的机制,杀虫剂经昆虫表皮、跗节、口器等途径进入体内直至引起死亡的过程,:,昆虫对杀虫剂产生抗性的原因,老鼠嘴巴越来越刁,蟑螂、蚊子练就,“,不坏金身,”,行为机制,昆虫通过改变自身行为习性而避免或减少与药剂接触，使其不被杀死。,表皮穿透性降低,由于表皮穿透性的降低而造成的抗性倍数很低，然而如果和其他抗性机制结合，将会产生极高水平的抗药性。,代谢作用增强,与害虫对有机氯、有机磷、氨基甲酸酯和拟除虫菊酯类等重要药剂的抗性有关。,靶标敏感性降低,靶标是各类杀虫剂重要的毒杀作用场所。,杀虫剂,与抗药性有关的作用靶标或代谢酶,DDT,Na,+,通道，多功能氧化酶，,DDT-,脱氢酶,六六六,氯离子通道，多功能氧化酶,有机磷,乙酰胆碱酯酶、多功能氧化酶、酯酶、谷胱甘肽,-s-,转移酶系,氨基甲酸酯,多功能氧化酶、酯酶,拟除虫菊酯,神经不敏感、多功能氧化酶、酯酶、表皮穿透性,烟碱、吡虫啉,乙酰胆碱酯酶受体,环戊二烯类、劲锐特,-,氨基丁酸（,GABA),受体,苏云金杆菌,中肠受体,常见杀虫剂的作用靶标或代谢酶,四、影响抗性发展的因素,遗传因子,抗性的发展是基因突变、基因流动及随机遗传漂移等因素间复杂的相互作用，而引起基因频率的改变。,抗性等位基因的起始频率,抗性等位基因数量,显性等位基因,抗性基因的外显率,农药的使用历史,抗性个体的适合度,生物学因子,世代周期和繁殖力,单配偶、多配偶和孤雌生殖,种群流动性,昆虫的食性,抗性个体的生存竞争力和庇护,其中主要涉及农药的使用次数和使用量。,农药的使用次数越多、剂量越大，其持效期越长，对害虫的选择时间越长。昆虫对药剂产生抗性的速度越快，反之则慢。,操作因子,药剂对昆虫的选择压力对害虫抗性产生有十分重要的作用，它是受人类活动直接影响的。这类影响因素属于人为抗性因子。,第二部分 抗药性的监测方法,抗性监测方法有生测法、生理生化测定方法和分子生物测定方法。,一、生测法,该类方法测定出抗药性的表现型，不能发现早期抗性基因频率的变化。,区分剂量法,毒力回归线测定方法,生测的注意事项,试验方法的标准化、试虫标准化、药剂标准化,;,根据药剂的作用方式选择生测方法，触杀作用：,a),点滴法,;b),喷雾法,;c),药膜法,;d),浸渍法。胃毒作用多用饲料喂食法；内吸作用多用寄主局部施药法或寄主喂食法等。,二、生物化学监测,生化监测方法可以使用酶标仪监测到每个个体靶标酶或代谢酶的变化，一般用,I50,(,药剂对酶的抑制中浓度,),表示药剂对离体酶的抑制能力；,Ki,表示酶与底物的结合能力的大小。乙酰胆碱酯酶和羧酸酯酶的测定方法见附录,2,，谷胱甘肽,-,s,-,转移酶的测定方法见附录,3,。,生物化学测定的缺陷只能测定一种酶的变化，抗药性的产生常常是多种酶共同参与的结果。,乙酰胆碱酯酶基因,钠离子通道基因,-,氨基丁酸受体突变与抗性的关系,酯酶扩增与抗药性的关系,多功能氧化酶,-,P450,与抗药性的关系,三、分子监测方法,杀虫药剂对靶标生物毒力的表示方法,半数致死量,LD,50,:,受试生物死亡一半需要的剂量值,单位：,mg/kg,，,ug/g,等，有时用,ug,/,头,LC,50,:,受试生物死亡一半需要的浓度值,单位：,mg/L,g/m,2,等,LT,50,:,在固定浓度下，受试生物死亡一半需要的时间,单位：分钟（,min,）或小时（,hr,）,击倒中时或中量,KT,50,：击倒受试生物一半需要的时间，单位,:min,或,hr,KD,50,：击倒受试生物一半需要的剂量，单位,:mg/kg,，,ug/g,等，有时用,ug,/,头,奔出效应,FT50,：使蜚蠊跑出一半需要的时间，单位,:min,或,hr,FD50,或,FC50,：使蜚蠊跑出一半需要的剂量，单位,:mg/L,g/m,2,等,时间浓度积,CT,50,：受试生物死亡一半需要的时间浓度积，即药剂浓,度和接触时间的乘积，单位是,min,g,/L,半数有效量,ED,50,：受试生物一半产生所希望的反应，需要的剂量值。,单位：,mg/kg,，,ug/g,，有时用,ug,/,头,EC,50,：受试生物一半产生所希望的反应，需要的浓度值。,单位：,mg/L,，,g/m,2,等,第三部分 抗性治理,抗药性问题中面临的最主要的难题,克服或延缓抗性的产生和发展，以及延长杀虫剂的有效使用寿命。,依赖于害虫的抗性遗传及种群生态学，通过选择相应的防治策略，来达到这一目的抗性治理便应运而生。,一、抗性治理的一般概念,在抗性产生的选择过程中，目标虫种的敏感性及施加于改虫种的选择压力（即杀虫剂等），是抗性形成的主要因素。,抗性治理最基本的出发点,:,降低杀虫剂的选择压；,利用抗性个体在停止用药后的繁殖劣势；,敏感个体的稀释作用。,抗性治理的实质,根据群体遗传学的原理，综合影响目标虫种，抗性变化的遗传学和生物学因子，使用不同的杀虫剂选择压，以达到阻止或延缓抗性的发展，同时又将目标种群的为害控制在经济阈值之下。也就是说，在控制目标种群的为害在经济阈值之下的前提下，保持该种群的敏感性。,尽可能将目标害虫的抗性等位基因频率控制在最低水平，以防止或延缓抗性发展,根据各类杀虫剂的作用机制，制定科学合理的用药防治方案,根据杀虫剂的特点和为害习性施药，尽可能在低的选择压力下，得到较好的防治效果,害虫抗性治理与害虫综合治理相结合,抗性治理的基本原则,敏感性资源的意义,杀虫剂的使用,减少害虫数量的同时，增加了抗性基因频率。,消耗了一部分害虫的敏感性。害虫对杀虫剂的敏感,性，在多次重复的使用一种药剂的过程中逐步丧失。,敏感性消失后，再想恢复基本不可能。,抗性的发展通常是在它开始出现后的很短时间内遍及整个地区,敏感性资源的再分配问题,使用敏感性资源，必须考虑两点,代别间和年度间的敏感性分配，取决于一定时间内害虫为害和杀虫剂的费用以及抗性发生的代价。,二、抗性治理策略,有害生物综合治理（,IPM,）的防治策略，通过以下措施降低药剂的选择压：,只有把,IPM,和化学防治有机的相结合才能真正控制抗性的发展。,天敌的引入和培育,昆虫疾病的利用,杀虫植物的栽培,其它非化学防治,保护性治理,即在昆虫对药剂产生抗性以前就实施抗性治理策略。,治疗性治理,即监测到害虫已经对某些药剂产生抗药性或防治,效果下降时实施抗性治理。,抗药性治理分为,抗性治理的三个基本策略,从化学防治的角度,【Georghiou(1983)】,“复合作用”这个术语用来表示长期或短期的多种作用的化学选择压。,“适度”和“饱和”主要是指防治时所用药剂的剂量而言。,适度治理,饱和治理,复合作用治理,限制药剂使用次数、用药时间及用药量，降低药剂总的选择压力；应用残效期短的药剂；避免使用缓释剂；定向选择成虫；在不用药阶段，利用种群中抗性个体适合度低的特点，使敏感个体的繁殖快于抗性个体，以降低整个种群的抗性基因频率。阻止或延缓抗性的发展。,某一代或留下一部分种群不处理；保持“庇护所”；提高防治限阈。,当抗性基因为隐性时，使用高剂量的杀虫剂施于靶标害虫，杀死抗性杂合子和敏感纯合子个体，并有敏感个体迁入，以稀释存活的少数抗性纯合子。降低抗性等位基因频率，延缓抗性发展。,用增效剂抑制解毒机制。,药剂混用；药剂轮用；药剂镶嵌式交替防治。,这些药剂因作用于不同的靶标、无交互抗性，使各种药剂在低的选择压力下，取得较好的杀虫效果，从而延缓抗性的发展。,换用改变靶标的新药剂；杀虫剂的剂型工艺。,卫生害虫防治中饱和治理和复合作用治理的应用较多,适度治理,饱和治理,复合作用治理,以上三种策略并非完全孤立，在同一个防治计划中，这些措施可相互渗透。这完全取决于所处的实际情况。,设计抗性治理方案的依据,通过抗性监测可以及时准确地知道抗性水平及其分布，尤其是早期抗性监测，对及时实施抗性治理可争得时间上的主动。,一般抗性恢复所用的时间比抗性产生要慢的多。,明确重点应治理保护的药剂类别及品种,抗性监测在抗性治理中的作用,评估抗性治理的实际效果,通过监测害虫抗性水平的变化，对整个治理方案或不同阶段抗性治理效果提供评估，也为抗性治理方案的修订补充提供依据。,为了达到将昆虫控制在危害的阀值以下，保护害虫对药剂的敏感性和延缓药剂的有效使用寿命的目的，抗性治理在综合治理策略原则的指导下，强调采取非化学方法，化学农药使用应科学合理，尽可能降低农药对昆虫的选择压力，延缓抗性发展，减少环境污染及破坏生态平衡等问题,。,第四,部分,全国重要病媒生物 抗药性监测（试行）方案,1.,方案,背景,2.,监测目的,2.1,掌握抗药性水平，指导防制,2.2,制定控制预案，提高疾控能力,3.,监测的组织、分工和职责,3.1,监测网络,以中国疾病预防控制中心传染病预防控制所媒介生物控制室为依托，以各省,(,自治区，直辖市,),为监测试点单位，监测点由监测试点单位设立。,3.2,分工和职责,3.2.1,中国疾病预防控制中心传染病所,3.2.1,省,(,自治区，直辖市,),疾病预防控制部门,4.,监测内容和方法,4.1,靶标昆虫（监测对象）,淡色库蚊,/,致倦库蚊的幼虫和成虫,家蝇成虫,4.2,监测点的选择,监测点要考虑地理分布（经纬度、生境），每省选两个有代表性的监测点进行。,监测点要相对固定。,监测点的选择必须考虑以下几点：,当地媒介生物性传染病的发生情况,相关疾病媒介生物的种类和发生强度,病媒生物对人的骚扰程度等选择,4.3,监测时间,在当地的发生高峰期，每,两,年进行一次，不同监测年份测定时间相对固定。,4.4,试虫采集,试虫的采集以居民区（城市或农村）及人活动频繁的区域（公园、绿化带、村庄周围,500,米内等）为主。,在其东、西、南、北、中,5,个方位采集样本，按接近等比例混合后进行抗药性测定。,抗药性监测，在采集试虫的当代或室内饲养的,1,2,代进行。,4.5,监测药剂,4.5.1,淡色库蚊,/,致倦库蚊的监测药剂,高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、双硫磷、仲丁威,4.5.2,家蝇的监测药剂,溴氰菊酯、高效氯氰菊酯、敌敌畏、残杀威。,其它药剂根据当地用药情况进行选择监测。,4.6,设施和器材,养虫室,吸蚊磁,通风橱,光照培养箱,点滴器,诱蚊灯,吸虫器,捕虫网,防蚊帽,移液器,电子天平,磁力搅拌器,4.7,监测方法,4.7.1,蚊虫幼虫浸渍法,以,4,龄初幼虫为测试对象，以丙酮将原药稀释，将待测药剂配置,5,7,个系列浓度，即在,250,毫升的烧杯（或白瓷碗等）中加入,200,毫升脱氯水和,0.5,毫升相应的药液，加入,20,30,头试虫，以,200mL,脱氯水为对照。,试虫在,251,、相对湿度为,7010,、光照黑暗,168,的条件下，,24,小时调查并记录各处理的死亡数。死亡判断标准，用锐器触动不能动的幼虫为死亡，只是震颤也视为死亡。试验重复,3,次。对照死亡率超过,20,，试验视为无效。,4.7.2,成蚊接触桶法,药纸的制备 将白油和乙醚,(AR),按,12,比例混合作为溶剂。杀虫剂按需要量溶解其中，配成一定浓度,附录,2,，吸取,2.14,毫升均匀滴于,16,厘米,12.5,厘米的新华,1,号滤纸或其他质量相近的滤纸上。,2,小时后待乙醚完全挥发即可应用。,药纸制备后应在,6,小时内使用，如需要可以把,l0,20,张药纸用大小相同的玻璃板夹紧，用橡皮膏把间缝封实，再装入黑纸袋中，在较低温下大约可以存放一个月，但一经开启即不能储存，必须在,2,3,天内用完，如果已经装入接触筒，就只能用一次。,先把恢复筒安装在放隔板的一面，用吸蚊器吸取,20,25,只雌蚊（羽化后,24,48,小时，未吸血）吹入筒内，然后关闭隔板，在隔板另一面装上已衬贴药纸的接触筒，把隔板抽开，将恢复筒内蚊虫轻吹入接触筒，迅速关上隔板，将筒平放，即开始计算接触时间，接触,60,分钟，完毕后再抽开隔板将蚊虫再吹入恢复筒，关上隔板，将筒直放，用浸有,5,葡萄糖水的棉花团置于尼龙网上。室温,252,，从接触完毕后,24,小时计算死亡率。为了便于蚊虫在恢复筒内停留，可用白纸衬贴在筒内上端,l,2,或,2,3,，空出下端，以便于观察死亡掉下的蚊虫。在,4,5,次重复中，每剂量应至少测,100,只蚊。,4.7.3,家蝇的监测方法,用丙酮（分析纯）将原药配成,5,7,个系列浓度。取,3,7,日龄，体重为,18,20mg,的家蝇成虫。,把含有乙醚（分析纯）的棉球将指形管口堵塞、轻度麻醉后，选健康雌虫，每处理,30,只置于平皿中，用点滴器（类型）将药液按浓度由低到高的顺序，点滴于中胸背板上，放入加有少量奶粉的,500,mL,洁净的烧杯中，以海绵或脱脂棉供水，在温度为,251,，相对湿度,60%,70%,的条件下用,1:1,白糖和奶粉混合物饲养,24 h,。记录各处理的死亡虫数。对照以丙酮处理，死亡率超过,20,时需要重新进行。试验重复,3,次。死亡判断标准：凡腹部上翻，六足抽搐，用探针触之不能翻身爬行者判为死亡。,附录,2,成蚊测定用药纸的计算,WHO,对纸上的剂量标准系以杀虫剂在白油中的浓度计算。如混合液的,l%,实际为,0.33%,。按照这种方法，每平方米滤纸滴混合液应为,107.1,毫升，乙醚全部挥发后仅残留白油,35.7,毫升，如含药量,1,，即为,0.357,克。滤纸的面积定为,1612.5=200,平方厘米，为,1,平方米,1/50,。,WHO,多年来皆以杀虫剂在溶剂中的百分率为剂量标准，如溴氰菊酯的标准剂量为,0.025,，实际每平方米药量,0.0089,克。,WHO,专家委员会认为百分率与墙面药量无直接联系，建议今后使用“克平方米 的计量单位。,4.8,统计与计算,用,POLO,软件或,DPS,软件进行数据统计，记录处理虫数、自由度。通过分析获得致死中浓度（,LC50,）或致死剂量（,LD50,）值及其,95,置信限，,LC90(,或,LD90,）及其,95,置信限，毒力回归线的斜率,b,值及其标准差，卡方值。,方法：用统计学生物测定中的机率分析。,机率分析的经验模型及其参数拟合方法由,Finney(1947),提出，且长期以来是杀虫剂毒力测定的通用方法。,工作科室：,消毒与病媒生物防制科,谢谢！,