第八章-病毒感染的分子生物学检验名师优质课获奖市赛课一等奖课件.ppt

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,本幻灯片资料仅供参考，不能作为科学依据，如有不当之处，请参考专业资料。,湖南省中医药大学生化与分子生物学教研室,Jake li,临床分子生物学检验,第八章 病毒感染分子生物学检验,第1页,感染性疾病是由特定病原体,感染机体后,所产生一类疾病。,病原体包含病毒、细菌、原虫、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体、放线菌和寄生虫等。可采取微生物学、生物化学、免疫学和血液学方法对这些病原体进行检测，不过这些方法受灵敏度和特异性限制，在明确病因、潜在感染、早期诊疗以及对病原体进行分类、分型判定等方面还存在着较大缺点。,伴随分子生物学突破性发展以及相关技术进步，优于传统诊疗方法分子诊疗技术在疾病早期诊疗、疗效监测、耐药基因分析等凸显优势，并被广泛应用于病原生物感染性疾病检测中。,第2页,第一节 病毒感染分子生物学检验策略,大约,70%,人类感染性疾病是由病毒引发,有超出,400,种以上病毒可感染人类。,病毒除引发急性感染外，与其它病原微生物相比，造成连续性感染比较多见。,所谓连续性感染是指在原发感染之后病毒不能从宿主中被去除，而且继续存留在机体特定细胞中。,病毒在机体内可连续数月至多年，可出现症状，也可不出现症状而长久带毒，成为主要传染源，如,HBV,、,HIV,等。所以对病毒感染个体进行动态监测病毒载量、分析病毒感染类型、检测耐药基因及抗议病毒疗效观察等显得尤为主要。,第3页,一、病毒感染普通性检出策略,病毒感染分子诊疗策略分为,普通性检出策略和完整性检出策略。,普通性检出策略,，,只能提供是否存在某种病病毒感染，即针对病毒特异性核酸序列经过惯用核酸杂交或,PCR,技术,直接检出病原体核酸,，临床可用作判断有没有感染和是何种病原体感染，是快速诊疗机体有没有病毒感染首选方法。,能够依据病毒本身保守序列（如,DNA,分子中一个核苷酸片段或蛋白质中氨基酸片段）设计,PCR,引物或制备特异性探针。,第4页,二、病毒感染完整性检出策略,完整性检出策略,，即不但对病原体存在是否做出明确判断，同时能够诊疗出病毒携带者和潜在性感染者，并能对病毒进行拷贝数测定、基因分型（包含亚型）检测和耐药性判定。常采取核酸杂交、,PCR,、基因芯片和,DNA,测序等技术。,第5页,第二节,乙型肝炎病毒分子生物学检测,乙型肝炎病毒（,hepatitis B virus,HBV,）是引发病毒性肝炎主要病原体之一。依据相关资料统计，全球约有,3.5,亿乙肝病毒携带者，我国约,50,70,人群感染过乙肝病毒，其中乙肝病毒携带者已超出,1.3,亿，肝癌发病率也在增加。,第6页,急性感染,慢性携带者,缓解,30-50 年,慢性肝炎,稳定,疾病进展,肝硬化,代偿性肝硬化,肝癌,死亡,非代偿性肝硬化,HBV,感染后能够引发急性、慢性病毒肝炎，而且与肝硬化和肝细胞癌发生、发展有亲密关系。,第7页,HBV,感染者可能转归,13,岁,25-30,岁,42,5,岁,免疫系统,免疫系统 免疫功效低下 慢性,识别病毒 去除病毒 重复去除 乙肝,幼年,感染,免疫功效正常,肝纤维化,终生不识别 病毒去除,肝硬化,失代偿性肝硬化,肝癌,终生携带,e,抗原,/e,抗体,无症状 血清转换,无体征 产生,s,抗体,第8页,一、乙型肝炎病毒基因组结构特征,乙型肝炎病毒属嗜肝,DNA,病毒科。,嗜肝病毒科有独特复制方式，病毒合成,以,RNA,中间体为模板，经反转录合成,DNA,链，,在一些方面，,HBV,与逆转录病毒有许多相同性。,第9页,HBV DNA,是带有单链区环状双链,DNA,分子，是已知可感染人类最小,DNA,病毒。,基因组长为,3.2kb,，相对分子量为,(1.62.0)10,6,。,HBV,两条链长度不等。长链为负链,L(-),：长度固定，携带有病毒全部编码,信息。为模板编码病毒蛋白；,短链为正链,S(+),：在不一样,分子中长度不等，约负链,50%,100%,。,（一）乙型肝炎病毒基因组结构,第10页,端,有一段短,RNA,，它们是引导,DNA,合成引物。两条链,5,端以,250-300,对碱基互补结合，所以也称黏性末端，是,DNA,保持双链环状基础，也是,HBV,最常整合到肝细胞染色体中,DNA,。,长链和短链,DNA5,端位置是固定，但短链,3,端是可变。在负链,5,端一低分子量蛋白质，在正链,5,第11页,在黏性末端两侧还各有,11,个核苷酸,(5-TCACCTCTGC-3),组成,顺向重,复序列,(DR),，,DR1,位于,长链,5,端，,DR2,位于,短链,5,端，中间相,隔,223,个核苷酸，,DR,是,DNA,成环及病毒复制,关键区域。,第12页,HBV DNA,为了能在细胞内独立复制，充分利用其遗传物质，其编码区有广泛重合，以扩允其编码容量。,多个,ORF,可读码,2,次以上，编码,2,个以上蛋白质。,HBV,基因组负链,DNA,核苷酸序列上含有,6,个开放读码框架（,ORF),，其中,S,、,C,、,P,、,X 4,个,ORF,是早已公认。,第13页,2,、,C,基因区,C,基因区分为前,C,区和,C,区两部分。,C,区由,459,个核苷酸组成，编码产物为,183,个氨基酸残基组成多肽序列，称为,C,蛋白（,HBcAg,）；,前,C,区由,87,个氨基酸残基组成，编码,29,个氨基酸残基组成多肽称为前,C,蛋白。,整个,C,基因区编码,212,氨基酸残基组成多肽称为乙型肝炎病毒,e,抗原（,HBeAg,）。,1,、,S,基因区,S,基因,区分为：前,S1,区,、前,S2,区和,S,区,。编码外膜蛋白，前,S,区与病毒嗜肝性相关。,S,区和前,S2,区基因长度是固定，前,S1,区基因在不一样亚型间有所差异，其氨基酸残基数在,108119,范围。,第14页,3,、,P,基因区：,是,HBV DNA,中最大一个,ORF,，与其它基因区都有重合，编码产物是乙型肝炎病毒,DNA,多聚酶蛋白,(HBV DNAP,）。,P,基因区中一些核苷酸也会发生点突变，造成,HBV DNA,多聚酶表示水平降低或完全阻断，经过研究,P,基因结构与功效，可深入探索抗,HBV,治疗新方法。,4,、,X,基因区：,是,HBV DNA,中最小一个,ORF,，,编码产物为,x,蛋白,(HBxAg),。,HBxAg,氨基酸残基数在,145154,之间，功效还未明确，可能是一个反式激活因子，与病毒基因组表示调控及,HBV DNA,整合,相关。,x,蛋白所诱生抗体常见于原发肝细胞癌患者体内。,第15页,(,二,),乙型肝炎病毒基因组编码产物,pre-S1 pre-S1,蛋白,pre-S2 pre-S2,蛋白,S HBsAg,pre-C HBeAg,C HBcAg,P DNAP,X HBxAg,HBV DNA,主要有四个开放阅读码框架，含有强大蛋白质编码功效。,HBV,结构蛋白包含,S,蛋白、,C,蛋白、,P,蛋白和,X,蛋白四大类，这些,HBV,结构蛋白不但与乙肝病毒颗粒装配相关，还与,HBV,基因组复制与表示调控相关，而且相关,S,基因区表示产物研究，对新型乙型肝炎疫苗研制含有极为主要意义。,第16页,1,、外膜蛋白,编码,HBV,外膜蛋白基因有三个起始密码子,(AUG),，一个终止密码，编码产物有三种。,因为,PreS1,在不一样亚型中有差异，所以不一样亚型外膜大蛋白肽链长度不等。,外膜主蛋白即,S,蛋白,由,S,基因编码，,因其分子量小亦称,小蛋白,。是,HBsAg,主要成份,，是含,226,个残基 一个疏水性蛋白，是病毒包膜蛋白及亚单位主要成份。,HBsAg,是机体受,HBV,感染主要标志之一。,第17页,外膜中蛋白,由前,S2,蛋白和小蛋白组成,。前,S2,基因编码,55,个氨基酸通常是亲水性，含有比,S,蛋白更强免疫原性，对,前,S2,蛋白免疫原性研究可为制备高效价乙肝疫苗提供依据。,外膜大蛋白,是前,S1,基因编码,由,389400,个氨基酸残基组成一个蛋白质，其分子量是,S,基因区编码产物中最大蛋白。外膜大蛋白有,两种不一样形式，,糖基化,gp42,和非糖基化,p39,，分子量分别是,42kDa,和,39kDa,。,一个完整病毒体含,300400,个,S,蛋白分子，,4080,个中蛋白和大蛋白分子。在病毒非复制期几乎含都是,S,蛋白，中蛋白小于,1%,，无大蛋白；而在病毒复制期,S,蛋白与中蛋白百分比为,10,：,1,，大蛋白少于是,1/20,。,第18页,2,、关键区蛋白,HBV DNA,关键基因区编码,HBcAg,和,HBeAg,。,HBcAg,蛋白由,C,基因开始编码,183,个氨基酸残基组成：,HBcAg,主要定位于感染,细胞核内,，而且,HBcAg,外面包裹,HBsAg,，故不易游离在血循环中，所以也就,不易从患者血清中检出,，但,HBcAg,也可在肝细胞膜表面表示。,HBcAg,中含有,T,细胞表位，是特异性细胞毒性,T,淋巴细胞（,CTL,）识别主要靶抗原之一。,第19页,HBcAg,抗原性很强，能刺激机体产生,抗,HBc,，但无中和作用，如检出高效价抗,HBc,，尤其是抗,HBc-IgM,则表示,HBV,在肝内处于,复制状态。,不一样亚型,HBcAg,长度不等，普通在,183214,个氨基酸。,HBcAg,相对保守，不一样亚型,HBcAg,变异率,6%,。,第20页,HBeAg,蛋白由前,-C,基因开始编码,（包含前,C,和,C,基因），由,212,个氨基酸残基组成：,HBeAg,为可溶性蛋白质，,游离于血中，可作为,HBV,复制及含有,强感染性一个指标。,抗,-HBe,能与受染肝细胞表面,HBeAg,结合，经过补体介导破坏受染肝细胞，有一定保护作用。,抗,-HBe,出现是预后良好征象。,第21页,前,-C,区是一个极易发生突变区域。,前,-C,基因突变后，造成,HBeAg,分泌水平下降或完全终止，形成,HBeAg,阴性前,C,区突变株，使受感染细胞不能被抗,-HBe,及对应细胞免疫所识别而去除，从而使变异株在抗,-HBe,阳性情况仍大量增殖。所以临床上将慢性乙型病毒感染,分为,HBeAg,阳性和,HBeAg,阴性两类患者,。对,HBeAg,阴性抗,-HBe,阳性患者应注意监测血中病毒,DNA,。,第22页,3,、,DNA,多聚酶蛋白,HBV DNAP,是由,P,基因区编码一个,依赖于,RNADNA,聚合酶，,含有逆转录酶活性。,HBV DNAP,存在,HBV,关键中。,HBV DNAP,含,832845,个氨基酸残基，其一级结构富含组氨酸，是一个碱性蛋白，分子量约,90kDa,，需要在,2,阶镁离子存在条件下起作用。,依据,HBV DNAP,基因功效，大致上将其分成,4,个功效性片段：从,HBV DNAP,蛋白质,N-,端，,依次为引物酶区、隔离片区、逆转录酶区和,RNaseH,区。,HBV DNAP ORF,突变可造成,HBV,复制停顿，提醒在这一区域进行定点诱变研究可为,HBV,治疗提供主要靶区。,第23页,4,、,X,蛋白,是由,X,基因编码，也称,HBxAg,，只存在于哺乳动物嗜肝病毒中。,X,蛋白分子量为,17,.,5kDa,，其功效复杂多样。,经过反式调控激活细胞信号转导系统，能直接或间接地损害宿主细胞，造成肝细胞凋亡、坏死甚至癌变。,X,基因区也,存在广泛碱基点替换突变和高频率缺失突变，,突变后会抵制,X,蛋白转录活性，使病毒复制水平下降，病毒蛋白合成降低，造成血清中各项标志物滴度下降甚至不能检出。,第24页,二、乙型肝炎病毒分子生物学检验,（一）,乙型肝炎病毒核酸检验,HBV DNA,是病毒复制和传染性直接标志。定量检测,HBV DNA,对于判断病毒复制程度、传染性大小、抗病毒药品疗效等有主要意义。,第25页,1,普通,PCR,技术,传统,PCR,方法检测,HBV DNA,灵敏度能够到达,ng,级水平，检测结果能直接反应,HBV,病毒,复制程度，,为临床提供从分子水平上对病原体进行诊疗提供依据。引物是,PCR,扩增关键，决定扩增特异性和敏感度。,PCR,引物常依据其,S,、,C,、,P,和,X,基因中高度保守序列来设计。,不足：不能进行准确基因定量、重复性差、扩增产物间污染所到假阳性多、强致癌物溴化乙啶使用等。,第26页,2,荧光定量,PCR,技术,荧光定量,PCR,法应用，能够在在进行,HBV DNA,检测同时使其进行相正确量化，这对于乙肝患者体内,HBV,复制及传染性有更直接了解，能准确地反应,HBV DNA,复制水平、病程改变和治疗恢复情况等。其特异性高，灵敏度可达,001fg,，检测范围为,2,.,5,10,2,2.5,10,9,copies/ml,。,第27页,3.,支链,DNA,技术,(bDNA,技术,),为一个与,PCR,不一样核酸探针杂交标识信号放大技术。,支链,DNA,是人工合成带有许多侧链,DNA,片段，在每个侧链上都有能够标识可被激发标志物。用,bDNA,信号放大系统检测标本中核酸时，靶核酸本身不被扩增，而是经过多个探针组成逐层信号放大，以检测核酸。,其基本原理为：,合成,3,个探针和,bDNA,分子，,3,个探针分别称为捕捉探针、靶探针,1,和靶探针,2,。将捕捉探针固相化在微孔板上，靶探针,1,可分别与待测核酸及固相化探针杂交，而靶探针,2,可分别与待测核酸及,bDNA,杂交。这么，在杂交反应完成后，就形成了固相,捕捉探针,靶探针,1,待测序列,靶探针,2bDNA,复合物，借助酶催化反应就能定量检测待测核酸含量。,第28页,bDNA,技术最大特点是对目标核酸直接进行检测，放大倍数确定，稳定性及重复性高，结果准确，技术操作中污染少。,该方法相对于,PCR,更易操作，只需将待测病毒裂解释放出核酸，并将其变性为单链，即可进行检测，不需事先将其纯化，所以也成为一个经典方法，受到广泛应用。,bDNA,技术缺点就是放大倍数少、敏感性低、检测范围窄，不适合用于低水平检测。,第一代,bDNA,检测范围在,3.510,5,5.710,7,copies/ml,之间，,第二代,bDNA,技术可达,210,5,copies/ml,，但仍不够高，从而限制了该方法应用。,第29页,4.,核酸杂交,将待测标本点状加样于硝酸纤维素薄膜上，与标识,HBV DNA,寡核苷酸探针进行斑点杂交，从而检测待测标本中是否存在,HBV DNA,，可定性或半定量，特异性好，但灵敏度不如,PCR,法。方法较烦琐，但不需特殊仪器设备。,液相杂交使用,125,I,标识核酸探针，与液相中变性,DNA,杂交。然后采取,闪烁计数仪定量检测标识探针。,其检测限为,110,6,copies/ml,或,1-2pg/ml,。,第30页,5.,杂交捕捉系统,该系统采取特异,RNA,探针与靶分子,HBVDNA,杂交形成,RNA-DNA,杂交分子。多个,RNA-DNA,杂交分子被通用抗体捕捉于微孔中，然后采取偶联有碱性磷酸酶多克隆抗体检测杂交分子（该过程产生信号放大）。偶联碱性磷酸酶采取发光底,1,，,2-,二二酮来检测。其信号能够被放大,3000,倍，检测限为,4.710,3,copies/ml,。,第31页,6.,基因芯片技术,依据乙型肝炎病毒高度保守特异性基因序列设计寡核苷酸探针制备基因芯片，将待测病人样本进行,PCR,扩增，,PCR,扩增同时进行产物荧光标识，标识产物与基因芯片进行杂交，杂交结果经扫描仪读数并输出图像，然后经过计算机分析，从而检测病人是否有病毒感染、感染病毒种类。,第32页,连续,HBV DNA,抑制,组织学改进,和,ALT,正常化,预防肝病进展,为肝硬化、肝衰竭,或肝癌,降低死亡,或进行肝移植,首要治疗目标,最终治疗目标,长久治疗,治疗目标,预防肝硬化,预防肝衰竭,预防肝癌,提升生存率,改进生活质量,（二）乙型肝炎病毒耐药性分析,第33页,免疫调整与抑制病毒,抑制病毒,拉米夫定,阿德福韦,恩替卡韦,替比夫定,Tenofovir,Clevudine,免疫调整,干扰素,a,PEG,干扰素,a,CD8+,HBV DNA,第34页,免疫调整与抑制病毒药品利与弊,免疫调整,优点,:,部分病人,HBsAg,消失,明确疗程,应答持久,缺点,:,注射,不良反应,禁忌证,抑制病毒,优点,:,快速抑制,HBV DNA,口服 方便,服药期间不良反应少,缺点,:,长久用药维持,病毒变异耐药,第35页,惯用抗,HBV,药品为核苷（酸）类似物，如拉米夫定、阿德福韦等，但在长久用药过程中，部分患者对药品产生了耐药性。,HBV,一旦出现耐药突变后肝功效恶化百分比显著增高。伴随服用拉米夫定时间延长，患者耐药性随之增加，服药,5,年耐药性可高过约,69%,。所以，对乙型肝炎病毒耐药性分析在指导临床用药和监测病情等方面都含有主要意义。,第36页,乙型肝炎病毒耐药性产生主要原因是,HBV,本身是一个变异较高病毒。,HBV,在复制过程中必须经过经过,RNA,中间体逆转录过程中，因为,HBV DNA,多聚酶含有逆转录酶性质，即缺乏严格校正功效，使其自发突变率高达,10,5,。慢性,HBV,感染者因为长久抗病毒治疗也会诱发病毒基因变异。人体免疫应答或疫苗接种等压力下,HBV,也可发生突变。,突变引发病毒生物学特征改变，使慢性,HBV,感染患者体内积累了大量基因序列突变,HBV,株，从而造成,HBV,感染发病机制改变、血清学检测指标以改变,(,免疫逃逸,),及药品抗性等，给,HBV,感染临床表现、诊疗、预后及防治等方面带来一系列复杂问题。,第37页,拉米夫,定,一,种能抑制乙型肝炎病毒复制核苷类药品，其作用机制：,核苷,(,酸,),类似物与,HBV DNAP,自然底物,(dNTP),竞争地与该酶结合,造成,HBV DNA,合成终止，到达抑制,HBV,复制目标。所以与,HBV DNAP,结合能力强弱决定了该类药品疗效。,第38页,当,HBV DNAP,氨基酸序列发生改变并影响到其空间构象发生改变时，使,HBV DNAP,与核苷（酸）类似物结合能力显著下降，于是就产生了对核苷酸类药品耐药性，发生耐药现象。,在拉米夫定抗,HBV,感染治疗中，,HBV,发生变异最为常见，这些变异发生在,HBV DNAP,基因区。,拉米夫定抗病毒治疗靶点在,HBV DNAP,逆转录酶区。,第39页,（三）乙型肝炎病毒基因分型,对致病乙型肝炎病毒可用不一样血清型或基因型进行描述。,依据,HBsAg,抗原性差异，将,HBV,分为,10,个血清型，其中主要有,adr,、,adw,、,ayw,和,ayr,。血清型分布有显著地域与种族差异，和国汉族以,adr,为主，,adw,次之。,依据,HBV,全核苷酸序列差异在,8%,或以上，或,S,基因序列差异在,4%,或以上标准，可将,HBV,划分为不一样基因型，,当前已经发觉,A,、,B,、,C,、,D,、,E,、,F,、,G,、,H,共,8,种基因型。不一样基因型序列长度不一样，主要是前,S1,区不一样。,第40页,HBV,血清型和基因型地理分布,基因型,血清型,流行地域,A adw2,ayw1,欧洲西北部、美国、非洲中部,B adw2,ayw1,中国大陆、台湾、日本、印度尼,西亚、,越南,C adw2,adrq+,adrq-,ayr,中国大陆、台湾、日本、韩国、,越南、玻利尼西亚,D ayw2,ayw3,地中海地域、印度,E ayw4,非洲西部,F adw4q-,adw2,ayw4,非洲中部和南部、玻利尼西亚,G adw2,法国、美国,H,血清型和基因型有一定对应性，但不一样血清型可为同一基因型，同一血清型又可分布于不一样基因型,第41页,三、分子生物学检验临床意义,1,、病毒载量检测,HBV DNA,检测是判断,HBV,复制水平和传染性强弱直接标志。定量检测,HBV DNA,，即对病毒载量进行测定，可用于确定被感染者病毒感染程度,HBV DNA,拷贝数越高，病毒复制越活跃，传染性超强，肝脏损害和肝脏组织炎症反应可能越重。,病毒载量检测用于临床疗效监测：,HBV DNA,达,10,7,拷贝,/,毫升以上时，提醒病毒复制活跃；,HBV DNA10,3,拷贝,/,毫升、,HBeAg,转为阴性、,ALT,正常患者预后会相对很好。,第42页,2,、病毒分型检测,HBV,基因型与,HBV,流行病学特点、,HBV,标志物表示、致病性、乙型肝炎病程、转归及对药品敏感性相关。,HBV,基因分型反抗病毒疗效监测意义。,不一样基因型,反抗病毒药品效果存在一定差异,用拉米夫定抗病毒治疗时，基因型,B,比基因型,C,有更加好应答：,用普通,IFN-a,治疗时，基因型,B,比基因型,C,对干扰素治疗应答率高。,第43页,HBV,基因型与基因突变之间存在一定关联。,不一样基因型易发生突变类型可能不一样。,基因型,B,以,YVDD,变异为主；基因型,C,以,YIDD,变异为主。,HBV,基因型与患者病情转归及患者年纪也相关系。,C,基因型感染者较,B,型感染者含有更高,HBeAg,阳性率，,C,基因型对肝损伤比,B,基因型严重。,A,基因型与肝脏慢性炎症相关。,D,基因型与急性自限性肝炎相关。,C,基因型比,B,基因型更轻易发展成为肝硬化，,C,基因型在高年纪段,HCC,患者中百分比高，,B,基因型在低年纪，尤其在,35,岁以下,HCC,患者百分比较高。,第44页,我国流行主要是,A,、,B,、,C,、,D,四种,HBV,基因型，另有混合型。,四种,HBV,基因型在中国地域分布主要概况,HBV,基因型 主要分布地域,A,基因型 仅见于少数地域,(,广西壮族自治区,),B,基因型 长江以南,C,基因型 长江以北,D,基因型 少数民族较多地域,(,西藏、新疆、宁夏等,),第45页,3,、耐药突变检测,HBV,耐药性检测在临床上主要是对,HBV DNA,聚合酶,P,基因检测，即判别是野生型,(Y,M,DD),还是存在耐药突变型,(Y,V,DD,或,Y,I,DD),检测结果可为抗病毒药品治疗中,HBV,耐药性产生提供依据。拉米夫定耐药突变主要集中在,552,位氨基酸,Y,M,DD,Y,V,DD/Y,I,DD,，而且,M552V,是拉米夫定耐药突变主要形式，可造成病毒复制反弹，,HBV DNA,及,ALT,水平升高。当前,YMDD,检测技术虽多,但尚无”金标准”,.,552,位蛋氨酸被缬氨酸所替换（,M552V,）,552,位蛋氨酸被异亮氨酸所替换（,M552I,）,第46页,HBV YMDD,变异直接测序结果图谱,第47页,PCR-RFLP,检测,HBV YMDD,变异,第48页,DNA,芯片技术诊疗,HBV YMDD,变异,第49页,另外，还有一部分患者,HBV,前,C,区,1896,位点（,G,1896,A,）发生突变，使编码色氨酸密码子,T,G,G,突变为终止密码子,T,A,G,，造成,HBeAg,全成终止，使乙肝患者对干扰素完全应答率下降，也是造成干扰素产生耐药性主要原因之一。,在慢性,HBV,感染患者长久抗病毒治疗中，应需要尤其注意对,HBV,耐药突变基因检测，及时了解患者体内,HBV,是否发生抗病毒药品耐药突变，对指导临床合理选择抗病毒药品、调整最正确治疗方案、监测抗病毒药品药效及实现个体化诊治等方面都有临床指导意义。,第50页,第三节,丙型肝炎病毒分子生物学检验,第51页,丙型肝炎病毒,(HCV),属黄病毒科。当前发觉约,90%,输血后非甲非乙型肝炎和,7080%,无输血史散发型非甲非乙型肝炎由,HCV,感染所致。部分,HCV,感染者不出现临床症状，但有,50%,会发展成为慢性，且易致肝硬化和肝癌。,第52页,HCV,主要经过血或血制品传染,(,输血、注射毒品、使用不洁净器械刺青和穿孔,),，或母婴和家庭内接触而取得。除了血液传染之外，,HCV,也可能会经由性行为与垂直传染来传输，在,HCV,感染者精液与阴道分泌物中能够发觉,HCV,病毒存在，当前也有一些汇报已经显示性行为是能够传输,HCV,。至今为止仍有不少感染者是因为不明原因而感染，所以似乎还有未知传染路径存在。,第53页,（一）丙型肝炎病毒基因组结构,HCV,呈球型颗粒，直径约,50nm,，有脂质包膜基因组为单链正链,RNA,病毒，链长约,9.5kb,。整个基因组只有一个,ORF,，编码,30113010,个氨基酸组成聚蛋白前体，该蛋白前体在病毒蛋白酶和宿主信号肽酶作用下，裂解为病毒结构蛋白和非结构蛋白。,第54页,在,HCV,基因组,中,5,端有一个长度和序列非常稳定非编码区（,UTR,）,，由,341,个核苷酸组成，形成,4,个二级结构域，,为病毒复制和翻译所必需,。此区是整个基因组中最保守区域,所以常选择此区域基因序列作为基因扩增靶序列，可检出已知全部,HCV,基因型。,3,端,UTR,包含,3,个结构域：靠近,5,端为基因型特异多变区；居中部分为,1,个多聚,U,区域（,poly U,），含有,5062,个核苷靶（不一样基因型长度不等），,对病毒,RNA,复制至关主要；,3,端尾部为高度保守发夹样结构，称为,X-tail,。经过定点突变破坏这一结构会造成,RNA,病毒复制显著降低,5,端,和,3,端,UTR,之间,ORF,分成,9,个区域：其中,NS5b,区域在不一样型,HCV,中同源性较低，可作为,HCV,分型依据。,第55页,（二）丙型肝炎病毒基因组编码产物,1,、结构蛋白,结构蛋白包含,关键蛋白,和,包膜糖蛋白,。它们分别是由,C,区,、,E1,和,E2/NS1,区,编码而来。,E2/NS1,区产物,N,端高变区,（,HVR,）在机体内变异程度可能与初始感染剂量、病毒复制效率、感染期限、宿主免疫反应、感染物异质性相关。,HVR,变异程度可预测患者对干扰素疗效。,HCV,利用包膜糖蛋白抗原变异及机体免疫选择压力，产生出逃避株，长久存留在患者体内造成感染慢性化。,第56页,2,、非结构蛋白,NS2,蛋白疏水性很强，与细胞膜相伴随。,NS3,蛋白是多功效蛋白，,N,端有蛋白酶活性，,C,端有解旋酶活性，,NS3,蛋白有强免疫原性，且在肝细胞恶性转化中也起主要作用。,NS4,蛋白质,包含,NS4a,和,NS4b,。,NS4a,能辅助,NS3,蛋白酶活性表示，,NS4b,为疏水性膜相关蛋白，可能在,HCV,复制酶复合体装配中起作用。,第57页,可用于检测患者血清中,HCV,抗体,NS5,蛋白可能为蛋白质，也含,NS5a,和,NS5b,两部分。,NS5a,蛋白是,HCV,复制酶复合体成份之一，含有各种功效，可与宿主蛋白相互作用，使体内细胞环境更适宜,HCV,复制，促进,HCV RNA,复制。,NS5b,为膜结合型磷蛋白，有,RNA,依赖,RNA,聚合酶活性，参加病毒,RNA,合成。可能与,HCV,感染所致肝细胞肿瘤发生相关。,第58页,二、丙型肝炎病毒分子生物学检验,（一）,丙型肝炎病毒核酸检测,肝组织内,HCV RNA,检测可应用斑点核酸杂交技术，血清中,HCV RNA,检测多采取,PCR,、核酸杂交、,bDNA,、基因芯片、转录介导扩增系统等技术。,第59页,（二）丙型肝炎病毒基因分型,1,、,HCV,基因型种类,依据全世界不一样地域分离,HCV,不一样株全部或部分基因组系统进化分析，,HCV,展现三个水平遗传变异性：,型：,各型核酸序列之间相差,31%34%,；,亚型：,序列之间相差,20%23%,；,准病毒株：,序列之间相差,1%10%,；,差异最大序列集中在,E1,和,E2,区，而,C,基因和一些非结构蛋白基因则相对保守。,5UTR,区序列最保守，种系改变程度及进化率很低，可用于区分主要基因型；,NS5b,区变异较大，易于区分不一样病毒株，常被选作亚型区分依据。,依据基因序列差异，将,HCV,分为,6,种基因型及,100,多个亚型。,第60页,2,、,HCV,基因分型惯用方法,当前,HCV,基因分型惯用方法有：,（,1,）测序分析法,可对,HCV,基因组,E1,、,NS5b,、,C,区直接进行测序和进化树分析，是,HCV,基因分型“,金标准,”。,（,2,）,PCR-RFLP,（,3,）实时荧光,PCR,（,4,）基因型特异性引物扩增法,（,5,）型,特异性核酸探针杂交法,（,6,）基因分型检测芯片,第61页,三、分子生物学检验临床意义,（,一）检测,HCV,抗体,用基因重组克隆表示,HCV,蛋白质或以合成多肽如关键蛋白,C22,及,NS3,、,NS4,、,NS5,区等非结构蛋白作为抗原，经过,ELISA,法、放射免疫法检测抗,HCV IgG,或,IgM,。若抗,HCV,IgM,阳性可对,HCV,感染进行早期诊疗，检出率可达,90%,以上。,（二）检测,HCV RNA,定性检测,HCV RNA,存在是,HCV,感染确实证标志，在,HCV,感染第一周内就能够检测出,HCV RNA,，处理了免疫学检测,“,窗口期,”,问题。,定量检测,HCV RNA,拷贝数，对动态监测,HCV,传染性、病毒复制情况、抗病毒药品疗效及判断患者预后等有主要临床价值。,第62页,（二）检测,HCV,基因型,1,、分布特征及传输路径,HCV1,、,2,、,3,基因型在全球范围内广泛分布，,HCV4,型主要分布在北非和中东国家，,HCV5,型主要分布于南非，,HCV6,型主要流行于东南亚。,1a,1b,2b,3a,5a,4,4,1a,1b 2a,2b,3a,1a,1b 2a,2b,2c,3a,1b,3a,3b,1b,6,2a,1b,1b,3a,第63页,HCV1b,型主要经血液传输，而,HCV1a,、,3a,主要经静脉注射毒品传输，这是当前,HCV,传输主要传输路径，占新发病例,70%,左右。,我国流行主要,HCV,基因型及亚型有,1b,、,2a,、,3a,、,3b,及,6a,。其中，,2,型为主。当前诊疗,2,型致病性强，复制快，复制产生病毒量多，症状较重，较难治疗。,2,、判断病情,在,HCV,感染整个过程中，宿主内,HCV,致病性展现显著生物学差异。有些感染,HCV,后短时间内就出现严重并发症，如肝纤维化和肝癌；有些即使感染时间,很久,却无并发症。当前多数研究认为：,HCV,基因型是主要影响原因。在慢性,HCV,感染患者中，与其它基因型相比，,1b,型感染与更严重肝脏疾病、更快速疾病恶化相关。所以，,HCV 1b,基因型可作为与较严重,HCV,相关性肝脏疾病标志物。,第64页,3,、预测疗效,HCV1b,及,1a,基因型比,HCV2,型或,3,型对干扰素治疗,SVR,（,连续病毒学应答）,要差。,如,HCV2,型感染患者,60%70%,在干扰素治疗,6,个月后有应答；而,HCV1,型感染患者只有,10%15%,有应答反应。,这种差异在干扰素治疗连续性应答方面经常出现，且不受肝脏组织学特点或治疗前,HCV,水平影响。,检测,HCV,基因型将有利于,HCV,感染者临床诊疗并预测治疗效果，也能为调整用药剂量及治疗时间、制订个体化抗病毒治疗方案提供指导。,治疗结束时病毒学应答,(ETR),在治疗末期检测不出,HCV RNA(HCV,基因型,2/3,型，治疗,24,周；,HCV,基因型,1,型，治疗,48,周）,持久性病毒学应答,(SVR),在随访期结束时检测不出,HCV RNA(,治疗结束后,24,周）,无应答,在治疗结束时仍能检测出,HCV RNA,反跳,在治疗期间检测不出,HCV RNA,，不过以后又检测出,HCV RNA,复发,在治疗结束时,HCV RNA,阴性，不过在随访期,HCV RNA,阳性,第65页,第四节,人乳头瘤病毒分子生物学检验,第66页,人乳头瘤病毒（,HPV,）是一个嗜上皮性病毒，含有高度组织和宿主特异性及将正常细胞永生化能力。可致人类皮肤黏膜异常增生，引发良性肿瘤和疣，如寻常疣、尖锐湿疣、,乳头状瘤；或造成癌变，如阴道癌、宫颈癌等，是一个常见性传输性疾病。,电镜下,HPV,HPV,是一个无包膜,双链闭环,小型,DNA,病毒。,球形，直径52-55,nm,。,由,DNA,关键和蛋白衣壳组成。衣壳由主要衣壳蛋白,(L1),和次要衣壳蛋白,(L2),组成。,第67页,一、人乳头瘤病毒基因组结构特征,(,一,),病毒人乳头瘤病毒基因组结构,HPV,基因组可分为三个区段：早期区（,E,）、晚期区（,L,）及长控制区（,LCR,）或称上游调整区（,URR,）或非编码区（,NCR,）。,早期区,长约,4Kb,，分为,E1E8,开放阅读框，其中,E3,和,E8,不是全部病毒基因组都有，还未发觉它们为病毒蛋白编码。,晚期区,约,3000bp,，有两个主要,ORF,，分别称为,L1,，,L2,，与,E,区转录方向一致。,长控制区,位于,E,区和,L,区之间，长约,1000bp,。,不一样,HPV,亚型,L,区,DNA,序列变异很大，为不一样亚型分型主要标准之一。,第68页,(,二,),病毒人乳头瘤病毒基因组编码产物,早期区主要编码与病毒复制、转录、调控和细胞转化相关蛋白。,E1,、,E2,、,E5,、,E6,和,E7,在上皮分化早期阶段表示。,其中,E6,、,E7,是潜在致癌基因,，在连续性,HPV,感染中高水平表示，分别编码含,158,和,98,个氨基酸残基病毒原癌蛋白，二者共同存在,Cys-x-x-Cys,基序，含有锌指结构，可分别结合抑癌基因产物,P53,和,RB,蛋白，造成细胞周期失控、细胞增殖和凋亡失调，增加特异性致癌作用。,Cys,；半胱氨酸,第69页,E2,负性调整,E6,和,E7,，,保持细胞分化成熟。,E4,可在上皮分化整个过程中表示,，能溶解细胞骨架蛋白，出现挖空细胞改变。,L1,和,L2,在上皮分化终末阶段表示,，分别编码主、次要衣壳蛋白，组装形成病毒衣壳，从细胞中释放完整病毒颗粒。,LCR,区含很多病毒,DNA,复制和转录调整所必需顺式作用元件，负责转录和复制调控。,第70页,二、人乳头瘤病毒分子生物学检验,（一）,人乳头瘤病毒核酸检测,1.,核酸杂交,采取核酸杂交技术检测,HPV DNA,，含有较强特异性，并能够分型。当前常采取,HCII,技术、核酸杂交技术与,PCR,相结合方法，能取得最正确检测结果。,（,1,）,HC-II,检验系统：,原理是利用反抗体捕捉信号放大和化学发光信号检测。,信号,检测,DNA-RNA,探针杂交,抗体捕捉,杂交分子,二抗结合杂交分子,DNA,分解,HC-II,基本试验步骤图示,第71页,检测/诊疗系统,企业,能够检测HPV型别,应用情况,HC2,Digene,HR(13,A,探针,cocktail):16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68,LR(5,B,探针,cocktail):6,11,42,43,44,FDA,认证并被使用,凯普HPV,分型,诊疗系统,凯普,HR(13):16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68,PHR(2):53,66,LR(6):6,11,42,43,44,81,欧盟及,SFDA,认证并被使用,Amplicor WMP,罗氏分子,诊疗,HR(13):16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68,-,罗氏,HPV,分型检测,罗氏分子,诊疗,HR(13):16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68,LR(24):6,11,26,40,42,53,54,55,61,62,64,66,67,69,70,71,72,73,81,82,83,84,89,c89,-,临床上常见,HPV,核酸诊疗系统,第72页,（,2,）核酸杂交技术与,PCR,结正当,：,惯用通用引物,-PCR,（,GP-PCR,）反向线性杂交技术、分子导流杂交技术和,PCR,酶标微孔板杂交技术。,（,3,）侵染检测技术,2,、,PCR,技术,（,1,）,GP-PCR,法,（,2,）实时定量,PCR,法,3,、基因芯片技术,4,、流式荧光液芯技术,5,、飞行时间质谱技术,第73页,流式荧光液芯技术,检测原理,采取流式荧光技术，同时检测,26,种人乳头瘤病毒,(HPV),