短链脂肪酸对抗生素相关性腹泻的作用及机制研究.pdf
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1、2023,27(19):61-66.实用临床医药杂志Journal of Clinical Medicine in Practice61:短链脂肪酸对抗生素相关性腹泻的作用及机制研究林?丽,谷翠红,王硕,黄姝怡,王丽红,张志华I(1.承德医学院附属医院血液内科,河北承德,0 6 7 0 0 0;2.河北医科大学第二医院血液内科,河北石家庄,0 50 0 0 0)摘要:目的探讨短链脂肪酸(SCFAs)对抗生素相关性腹泻(AAD)的作用及机制。方法采用林可霉素注射液灌胃法建立大鼠AAD模型并随机分为AAD组、低剂量SCFAs组、高剂量SCFAs组,另将正常大鼠设为对照组,每组6 只。低剂量SCFA
2、s组、高剂量SCFAs组分别灌胃10 0、150 mg/(k g d)SCFA s(乙酸+丙酸+丁酸混合液,三者比例为3:1:1),AAD组、对照组均给予生理盐水10 mL/(k g d),各组均连续灌胃15d。记录并比较各组大鼠腹泻情况、结肠组织变化、炎症因子水平和肠道菌群情况。结果对照组大鼠饮水和进食正常,二便正常;AAD组大鼠饮水量增加,进食量减少,粪便稀软不成形;低剂量SCFAs组、高剂量SCFAs组大鼠进食较少,饮水量正常,偶见软便。各组大鼠给药15d时的体质量比较,差异有统计学意义(P0.05)。结肠组织观察结果显示,对照组黏膜上皮结构完整,AAD组黏膜固有层内较多炎性细胞浸润,低
3、剂量SCFAs组、高剂量SCFAs组黏膜上皮结构完整,炎性细胞浸润较AAD组减少。与对照组比较,AAD组大鼠结肠长度、结肠组织内杯状细胞数量和革兰阴性杆菌比例减少,白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-(T NF-)、白细胞介素-1(IL-1)mR NA 相对表达量和脾脏指数、革兰阳性杆菌比例增加,差异有统计学意义(P0.05);与AAD组比较,低剂量SCFAs组、高剂量SCFAs组大鼠结肠长度、结肠组织内杯状细胞数量增加,IL-6、T NF-、I L-I mRNA相对表达量减少,脾脏指数降低,差异有统计学意义(P 0.0 5),且以上指标的改善呈剂量依赖性趋势。结论SCFAs干预有助于促
4、进AAD大鼠肠道屏障功能恢复,这可能与SCFAs能调节炎性细胞因子,改变肠道菌群组成,减轻AAD所致肠黏膜损伤有关。关键词:血液肿瘤;抗生素相关性腹泻;短链脂肪酸;肠道微生态中图分类号:R733;R 442.2 文献标志码:A文章编号:16 7 2-2 353(2 0 2 3)19-0 6 1-0 6 DOI:10.7 6 19/j c m p.2 0 2 32 145Roles of short-chain fatty acid in antibiotic-associateddiarrhea and its mechanismLIN Li,GU Cuihong,WANG Shuo,HUAN
5、G Shuyi?,WANG Lihong,ZHANG Zhihua(1.Department of Hematopathology,the Afiliated Hospital of Chengde Medical College,Chengde,Hebei,067000;2.Department of Hematopathology,the Second Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang,Hebei,50000)Abstract:Objective To investigate the effect of short-chai
6、n fatty acid(SCFAs)on antibiotic-associated diarrhea(AAD)and its mechanism.Methods AAD models were established by givinglincomycin injection fluid by gavage and randomly divided into AAD group,low dose SCFAs groupand high dose SCFAs group.The normal rats were included in control group,with 6 rats in
7、 pergroup.The control and AAD groups were treated with 10 mL/(kg d)normal saline,while the lowdose and high dose SCFAs groups were gavaged SCFAsa mixture of acetic acid,propionic acid andbutyric acid,at a ratio of 3:1:1 for 100 mg/(kg d)for 100,150 mg/(kg d),respectively.Allgroups were treated for 1
8、5 days.The diarhea,changes of colonic tssue,levels of inflammatory fac-tors and gut microbiota were recorded and compared in each group.Results The rats in the controlgroup were normal in water and food intake,and had normal stools and urine.The rats in the AADgroup showed increased water intake,dec
9、reased food intake,loose and irregular feces.The rats in thelow dose SCFAs group and high dose SCFAs group had less intake of diet,normal water intake andoccasional soft stools.There was a statistically significant difference in body weight among thesegroups at 15 d after treatment(P0.05).The coloni
10、c tissue showed that the mucosal epithelialstructure was intact.Severe inflammatory cell infiltration in mucous lamina propria was observed inthe AAD group,and the mucosal epithelium structure was intact in low dose SCFAs group and high收稿日期:2 0 2 3-0 7-0 5基金项目:河北省医学科学研究课题计划(2 0 2 10 931);河北省承德市科学技术研
11、究与发展计划项目(2 0 2 0 0 6 A084)通信作者:张志华,Ema i l:z z h a n g h u a 16 3.c o m修回日期:2 0 2 3-0 9 1362dose SCFAs group,and inflammatory cell infiltration was less than that in the AAD group.Comparedwith the control group,the colon length,the number of Goblet cell and the proportion of Gram-nega-tive bacilli i
12、n the colon tissue of the AAD group were decreased,while the relative expression of inter-leukin-6(IL-6),tumor necrosis factor-(TNF-)and interleukin-1(IL-I)mRNA,spleen in-dex,and proportion of Gram-positive bacilli were increased in the AAD group(P 0.05).Com-pared with AAD group,the length of colon,
13、the number of Goblet cell in colon tissue of the low doseand high dose SCFAs groups were increased,the spleen index was decreased,and IL-6,TNF-,IL-1 mRNA were reduced(P0.05),showing a SCFA dose-dependent trend.Conclusion SCFAsis helpful to promote the recovery of intestinal barrier function of AAD,w
14、hich may be related tofunctions of SCFA,including regulating inflammatory cytokines,changing the composition of Gutmicrobiota and alleviating the intestinal mucosal damage caused by AAD.Key words:hematological tumors;antibiotics associated diarrhea;short-chain fatty acid;in-testinal microecology血液肿瘤
15、为起源于造血系统的恶性疾病的总称,包括白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤及骨髓增殖性疾病等。近年来,随着放化疗、靶向治疗、细胞免疫治疗及造血干细胞移植等方法的应用,血液肿瘤患者的预后大大改善1。但放化疗可引发中性粒细胞减少,免疫抑制剂靶向药物相关的T淋巴细胞和B淋巴细胞功能异常等大大升高患者感染率,严重影响预后。针对血液肿瘤合并感染情况,广谱抗生素为首选的治疗手段2 。抗生素相关性腹泻(AAD)是广谱抗生素治疗血液肿瘤感染的主要并发症,发生率近40%,常伴有肠道菌群及代谢物的变化3。目前,AAD尚无理想的治疗药物,临床一般采用支持治疗、益生菌制剂及粪便移植治疗等重建肠道微生态平衡,但疗效有限且具有潜
16、在的副作用4研究5 表明,发生AAD时,肠道菌群变化使得代谢物如短链脂肪酸(SCFAs)的含量明显下降。SCFAs作为肠道厌氧菌发酵抗性淀粉及膳食纤维等产生的主要代谢物,主要包括乙酸、丙酸、丁酸(三者比例为3:1:1)6 ,不仅可作为肠上皮细胞能量代谢的底物,还可参与维持肠道屏障功能完整性及免疫应答功能。多项研究7-8 显示,应用天然化合物及其成分干预AAD,可通过增加产SCFAs菌的丰度而增强肠黏膜屏障功能,减轻肠黏膜损伤,但肠道补充SCFAs对AAD的疗效尚未明确。本研究观察肠道补充 SCFAs对AAD大鼠体质量、结肠长度、脾脏指数、肠道菌群、肠黏膜组织炎症因子水平及结构的影响效果,探讨S
17、CFAs 对AAD肠道损伤的作用机制,以期为血液肿瘤合并AAD的临床治疗提供参考。实用临床医药杂志Journal of Clinical Medicine in Practice1材料与方法1.1药物和试剂盐酸林可霉素注射液(华北制药股份有限公司,国药准字H3020455),乙酸钠盐、丙酸钠盐(美国Sigma公司),丁酸钠盐(阿拉丁)。1.2实验动物无特定病原体(SPF)级6 周龄SD大鼠24只,雌雄各半,体质量2 30 2 50 g,购自北京维通利华实验动物有限公司,合格证号为SYXK(京)2 0 2 2-0 0 52。大鼠饲养于承德医学院附属医院动物实验中心SPF级实验动物房,室温2 0
18、22,12 h 黑暗与12 h光照循环。饲养使用标准鼠饲料和水,所有动物实验按照承德医学院附属医院动物伦理委员会相关规定进行。1.3方法1.3.1AAD大鼠模型制备及分组:将大鼠适应性饲养7 d,灌胃3.0 g/(k g d)林可霉素注射液,连续7 d。实验过程中每天观察大鼠精神状态、体毛、饮食、活动度、体质量、粪便状况及尾部肛口洁净程度等,出现软便、稀便或黏液视为AAD大鼠模型制备成功。将制备成功的18 只AAD大鼠按照随机数字表法分为AAD组、低剂量SCFAs组、高剂量SCFAs组,另将正常大鼠(每天灌胃生理盐水)设为对照组,每组6 只。对照组、AAD组均灌胃生理盐水10 mL/(kgd)
19、,低剂量 SCFAs 组、高剂量SCFAs组分别灌胃10 0、150 mg/(k g d)乙酸+丙酸+丁酸混合液(乙酸:丙酸:丁酸比例为3:1:1),所有组别连续灌胃15d。1.3.2结肠长度测量和脾脏指数计算:末次给第2 7 卷第19期药后30 min,安乐处死大鼠,取各组大鼠结肠和脾脏,用直尺测量结肠的自然长度;用滤纸吸干脾脏表面残血后称质量,脾脏指数=脾脏质量(mg)/体质量(g)10。1.3.3结肠组织病理学观察:取部分病变结肠组织置于4%多聚甲醛中固定、脱水、包埋、切片、脱蜡,行苏木精-伊红(HE)染色,二甲苯透明,中性树脂封片,于显微镜下拍照观察。1.3.4结肠组织炎症因子水平检测
20、:采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测结肠组织炎症因子白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-(T NF-)、白细胞介素-1(IL-1)水平,取部分病变结肠组织,以Trizol法提取各组结肠组织总RNA,将RNA逆转录为cDNA,随后进行qPCR,反应所需引物序列见表1,采用2-AACi法进行mRNA相对表达量分析。表1RT-qPCR引物序列基因序列(5-3)IL-6上游:CCAGTTGCCTTCTTGGGACT下游:GGTCTGTTGGGAGTGGTATCCTNF-上游:ACTCCAGGCGGTGCCTATG下游:GAGCGTGGTGGCCCCTIL-1上游:GTCCCTCT
21、GGAGAAGCTGTG下游:GAAGGTCCACGGGAAAGACACGAPDH上游:TCTGTCCGTCGTGGATCTGA下游:CCTGCTTCACCACCTTCTTGA1.3.5结肠杯状细胞观察:取部分病变结肠组织,脱蜡前步骤同“1.3.3”,经阿利新蓝染液浸组别n对照组6249.17 10.65AAD组6244.00 13.37低剂量 SCFAs组6245.17 13.38高剂量SCFAs组6246.50 10.63F0.203P0.893与对照组比较,*P0.05;与AAD组比较,#P0.05。2.2各组大鼠结肠长度、脾脏指数比较与对照组比较,AAD组大鼠结肠长度减少,脾脏指数增加
22、,差异有统计学意义(P0.05);与AAD组比较,低剂量SCFAs组、高剂量 SCFAs组大鼠结肠长度增加,脾脏指数降低,且呈剂量依赖性趋势,差异有统计学意义(P0.05),见表3。2.3各组大鼠结肠组织病理学比较对照组:黏膜上皮结构完整,肠腺丰富,排列实用临床医药杂志Journal of Clinical Medicine in Practice染、PAS氧化剂氧化、Schiff染色液浸染,苏木精染色液染核,酸性分化液分化,Scott蓝化液返蓝,逐级常规乙醇脱水,二甲苯透明后以中性树胶封固,于镜下观察结肠杯状细胞。1.3.6结肠内容物革兰染色:取各组大鼠结肠内容物直接涂片,自然干燥,进行革兰
23、染色。1.4统计学分析采用SPSS26.0统计学软件进行数据分析,计量资料采用(xs)表示,多组比较采用单因素方差分析,组内两两比较采用LSD-t检验,P0.05为差异有统计学意义。2 结 果2.1各组大鼠精神活动状况、体质量比较对照组大鼠活泼好动,毛发有光泽,二便正常,饮水和进食正常;AAD组大鼠行动迟缓,毛发粗糙,有轻微脱毛现象,体质量增长缓慢,饮水量增加,进食量减少,粪便稀软,不成形,呈烂泥状;低剂量SCFAs组、高剂量SCFAs组大鼠活动较少,毛发略有光泽,进食较少,体质量增长,饮水量正常,偶见软便。给药15d时,与对照组比较,AAD组大鼠体质量降低,差异有统计学意义(P0.05);与
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