GB∕T 40249-2021 斑节对虾杆状病毒病诊断规程 PCR检测法.pdf
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1、ICS 65.020.30 CCS B 41 中华人民共和国国家标准GB/T 40249-2021 斑节对虾杆状病毒病诊断规程PCR检测法Code of diagnosis for infection with Penaeus monodon-type baculovirus一PCR method 2021-05-21发布国家市场监督管理总局申+国家标准化管理委员会保W2021-12-01实施GB/T 40249-2021 目。吕本文件按照GB/T1.1-2020(标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的
2、责任。本文件由中华人民共和国农业农村部提出。本文件由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归口。本文件起草单位:中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推广总站。本文件主要起草人:杨冰、万晓援、黄健、李清、史成银、张锋、宋晓玲、余卫忠、张庆利、李晨、刘莉、许华。I 1 范围斑节对虾杆状病毒病诊断规程PCR检测法GB/T 40249-2021 本文件规定了斑节对虾杆状病毒病诊断规程中普遍适用的核酸检测技术的要求,针对斑节对虾杆状病毒CPeeusmonodon-type baculovirus, MBV) ,给出了PCR检测法所需试剂或材料、仪器设备、样品、试验步骤和结果判定。本文件
3、适用于对虾各生活期样品中MBV带毒情况的定性检测,以进行斑节对虾杆状病毒病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/ T 28630.4-2012 臼斑综合征CWSD)诊断规程第4部分:组织病理学诊断法3 术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4 缩略语下列缩略i吾适用于本文件。bp:碱基对Cbase pair) DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) dNTPs:脱
4、氧核糖核昔三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate) EB:澳化乙院Cethidium bromide) EDTA:乙二胶四乙酸Cethylenediaminetetraacetic acid) HCl:盐酸Chydrogen chloride) MBV:斑节对虾杆状病毒CPenaeusmonodon-type baculovirus) NaOH:氢氧化铀(sodium hydroxide) PCR:聚合酶链式反应(polymerasechain reaction) SDS:十二烧基硫酸(sodiumdodecyl sulfate) Taq:水生栖热菌(ther
5、musaquaticus) T E : Tris盐酸和EDTA缓冲液(EDTATris日Cl)Tris:三起甲基氨基甲皖Ctris hydroxymethyl aminomethane) GB/T 40249-2021 5 试剂或材料5.1 除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馆水或去离子水或相当纯度的水。5.2 元水乙醇。5.3 TE缓冲液:按附录A中A.3配制。5.4 抽提缓冲液:按A.6配制。5.5 蛋白酶K:按A.7配制。5.6 10 mol/L乙酸镀:按A.8配制。5.7 Tirs饱和盼(pH注7.8)。5.8 酣/氯仿/异戊醇(25: 24 : 1)。5.9 氯仿/异
6、戊醇(24: 1)。5.10 1 X电泳缓冲液:按A.10配制。5.11 70%乙醇:按A.11配制。5.12 dNTPs(各2.5mmol/L):生化试剂,含dATP、dTTP、dGTP、dCTP各2.5mmol/L的混合物,20 oc保存,用于PCR。5.13 10XPCR缓冲液:生化试剂,无Mg2十离子,-20oc保存。5.14 MgC12 (25 mmol/L):生化试剂,-20oc保存。5.15 Taq DNA聚合酶(5U/f-1L):生化试剂,-20oc保存。5.16 引物261F(lOmol/L) : 5 -AAT-CCT-AGG-CGA-TCT-TAC-CA-3 , ,-20
7、oc保存。5.17 引物261R(lOf-1mol/L) :5-CGT-TCG-TTG-ATG-AAC-ATC-TC-3, -20 oc保存。5.18 内参引物CF(10mol/L): 5 -TGC-CTT-ATC-AGC-TNT-CGA-TTG-TAG-3 , ,-20 oc保存。5.19 内参引物CR(lOmol/L): 5-TTC-AGN-TTT-GCA-ACC-ATA-CTT-CCC-3 ,一200C保存。5.20 PCR检测阳性对照:为已知受MBV感染且PCR结果显示阳性的对虾组织样品,-80oC保存。5.21 PCR检测阴性对照:为已知未受MBV感染且PCR结果显示阴性的对虾组织样
8、品,-80oC保存。5.22 PCR检测空白对照:灭菌双蒸水。5.23 琼脂糖:生化试剂。5.24 DNA分子量标准:生化试剂。5.25 6 X载样缓冲液:生化试剂。5.26 10 mg/mL EB贮存液:按A.12配制,或其他等效产品。6 仪器设备6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 6.9 6.10 2 PCR仪。电泳仪。水平电泳槽。紫外观察仪或凝胶成像仪。高速离心机。水浴锅或金属浴。普通冰箱。-80oC超低泪冰箱。电炉或微波炉等其他加热设备。微量移液器:量程0.5L10L、2L20L、20L200L、100Ll000L。GB/T 40249-2021 7 样晶7
9、.1 采样对象斑节对虾(Peneusmonodo)等易感对虾。参见附录B。7.2 采样数量、方法和保存运输采样数量、方法和保存运输应符合GB/T28630.4-2012中附录B的要求。7.3 样品的采集7.3.1 对虾仔虾取完整个体;幼虾、成虾和亲虾取肝膜腺和肠道;亲虾的非致死性取样可采集粪便。7.3.2 分子生物学检测时,仔虾或未达到0.5g样品可以合并样本,个体稍大的虾可取个体进行检测。所取样品分别置于1.5mL离心管中,立即进行DNA提取操作或暂时保存于20 oC。8 试验步骤8.1 DNA的提取8.1.1 取30mg50 mg组织样品,加人抽提缓冲液500L,充分研磨,37oC温浴1h
10、。提取过程同时设置阳性对照和阴性对照。8.1.2 加入2.5L20 mg/mL蛋白酶K,至终浓度100g/mL,混匀后置于50oC水浴3h,不时旋动。8.1.3 将溶液冷却至室温,加人等体积平衡盼,颠倒混合10min,于10000 r/min离心3min分离两相。8.1.4 水相移至新1.5mL离心管中,加人等体积酣/氯仿/异戊醇(2524 : 1),颠倒混合10min,于10 000 r/min离心mm分离两相。8.1.5 水相移至一新1.5mL离心管中,加入等体积氯仿/异戊醇(24: 1),颠倒混合10min,于10000 r/min 离心1min分离两相。8.1.6 水相移至一新1.5m
11、L离心管中,加入100L10 mol/L乙酸钱,混匀后,再加人两倍体积预冷无水乙醇(-20 oC)氓匀,一20oC放置2ho 10 000 r/min离心10min,弃上清。8.1.7 用70%乙醇洗涤沉淀2次,每次10000 r/min离心5min,小心弃掉上清,将沉淀于室温晾干。8.1.8 加入100!lL灭菌双蒸水溶解DNA。8.1.9 若DNA样品需要保存,可溶解于100LTE缓冲液中并保存于一20oC。8.1.10 可采用同等抽提效果的其他方法或使用商品化DNA提取试剂盒。8.2 PCR扩增8.2.1 PCR反应体系:按照表1的要求,加入除T叫DNA聚合酶以外的各项试剂,配制成大体积
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