NY∕T 2960-2016 兔病毒性出血病病毒RT-PCR检测方法(农业).pdf
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1、ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 2960一2016兔病毒性出血病病毒RT-PCR,检测方法Detecting method for rabbit haemorrhagic disease virus by RT -PCR 2016-10-26发布2017-04-01实施中华人民共和国农业部发布NY/T 2960-2016 目IJr:I 本标准按照GB/T 1. 1-2009给出的规则起草。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口o本标准起草单位:中国动物卫生与流行病学中心、江苏省农业科学院兽医研究所、河南牧业经济学院。本标准主要起
2、草人:邵卫星、王芳、魏荣、胡波、徐耀辉、魏后军、孙映雪、李卫华。I NY/T 2960-2016 兔病毒性出血病病毒RT-PCR检测方法范围本标准规定了检测兔病毒性出血病病毒RT-PCR检测方法的技术要求。本标准适用于检测疑似兔病毒性出血届.ri.温民EE器及鼻腔分泌物的兔病毒性出血病病毒核酸。2 缩暗语下列缩略语适用EB:、漠化乙链(Oligo d(T)l RHD: RNA: RT-Taq酶:TBE:T bp:碱基dNTPs: 3 3. 1 3. 2 3. 3 核酸电泳3.4 恒温水浴锅3. 5 20C80C冰3. 6 微量移液器(0.3.7 凝胶成像系统(3. 8 生物安全柜。4 试剂4.
3、 1 AMV反转录酶或其他反转录酶。4.2 RNA酶抑制剂。4.3 Taq DNA聚合酶。4.4 dNTPs。4. 5 TRIZOL RNA提取试剂。4.6 1.0%琼脂糖凝胶,见A.l。4.7 5X TBE缓冲液,见A.2。4.8 DNA染料:澳化乙链(EB)。1 NY/T 2960-2016 警告:电泳中用到的EB可诱发基因突变,在操作中应戴手套和口罩。试验中被EB污染的物品要有专用收集处,并进行无害化处理。4. 9 焦碳酸二乙醋(DEPC)水,见A.3。警告;DEPC对眼睛和呼吸道黯膜有强剌激,在操作中应在通风条件下进行。使用时戴手套和口罩,不小心沾到皮肤应立即冲洗。4. 10 异丙醇:
4、一180C以下预冷。4.11 75%乙醇:一180C以下预冷。4. 12 氯仿。警告:氯仿毒性属中等毒性,吸入或经皮肤吸收会引起人体不适及皮肤黯膜剌激症状,在操作中应在通风条件下进行。使用时戴手套和口罩,不小心沾到皮肤应立即冲洗。4.13 DNA分子量标准(DL2000 DNA Marker)。4.14 6X电泳上样缓冲液。5寻|物5. 1 反转录引物见B.1。5.2 PCR引物见B.2。6 操作程序6. 1 样品的采集及处理过程的注意事项采样过程中样本不得交叉污染,采样、样品处理及RNA提取过程中应戴一次性手套和口罩。6. 2 样品的采集及处理6.2. 1 肝脏等脏器的采集和处理无菌取疑似R
5、HD死亡兔肝脏等脏器5g,分别剪碎作为检测样品。同时,以RHD死亡兔和正常兔肝脏等脏器分别作为阳性和阴性对照样品,同样处理。一180C以下冰箱可保存1个月。运输过程中需加冰袋保存。6. 2. 2 鼻腔分泌物的采集和处理用DEPC水润湿棉签拭子,深入兔鼻腔内部涂抹数次,然后放到含0.2mL DEPC水的EP管中。-180C以下冰箱可保存1个月。运输过程中需加冰袋保存。6.3 RNA的提取6. 3. 1 TRIZOL 法实验室没有商品化RNA提取试剂盒采用此方法。将5倍样品量的DEPC7.K加人脏器组织中,研磨成悬液,装人DEPC处理过的EP管中,一180C以下反复冻融3次,5000g离心5min
6、,取200L上清液作为待提取样品(浸泡于EP管中的棉签拭子,经反复挤压5次后,5000 g离心5min,取200L上清液作为待提取样品)。然后,加入700LTRIZOL, 振荡混匀后,室温放置10mi口,加人氯仿300L。振荡?昆匀后,室温放置30min, 40C 10000 g离心15mlno取上层水相600L,加人等体积的异丙醇,混匀,一180C以下放置2h以上或过夜,40C10000 g离心15min,去上清液,缓缓加入75%乙醇1mL洗涤,40C5000 g离心5min,去上清液,室温干燥20mln,加入DEPC水10L,使充分溶解。6.3.2 试剂盒法实验室有商品化RNA提取试剂盒采
7、用此方法。6.4 反转录(RT)6.4. 1 RT反应体系RNA dNTPs(10 mmol/ L) RNA酶抑制剂(RNaseInhibitor) (40U/L) AMV反转录酶(5U/L)5XAMV反应缓冲液Oligo d(T)18(反转录引物)总体积(Total)6.4.2 RT反应程序5. 75L 1.0 L O. 25L O. 5L 2. 0 L O. 5L 10.0 L NY/T 2960-2016 300C 10 min,420C 30 min, 990C 5 min,取出,可以直接作为模板进行PCR,或者放于180C以下保存备用。试验中同时设立阳性对照和阴性对照。6.5 PCR
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